6
2.3. Total Karbohidrat dalam Bahan Pangan dan Metode Analisisnya 2.3.1. Definisi total karbohidrat
Total karbohidrat atau total karbohidrat menurut Badan Pengawasan Obat dan Makanan 2005 meliputi gula, pati, serat pangan dan komponen karbohidrat lain. Pernyataan jumlah total
karbohidrat dalam gram penyajian yang dinyatakan dengan nilai gram terdekat, jika penyajian kurang dari 0,5 gram, jumlah kadarnya dapat dinyatakan sebagai nol dan jika penyajian lebih dari
0,5 gram dibulatkan ke kelipatan 1 gram terdekat. Total karbohidrat dapat dinyatakan dengan total karbohidrat by difference.
Total karbohidrat dalam pengukuran karbohidrat dengan metode langsung dinyatakan dalam bentuk persen yang setara dengan glukosa. Satuan glukosa glucose equivalent juga dapat diganti
dengan larutan gula lain yang dijadikan sebagai larutan standar.
2.3.2. Metode analisis total karbohidrat
Sejumlah teknik analisis telah dikembangkan untuk mengukur jumlah dan tipe karbohidrat yang ada di bahan pangan. Kadar karbohidrat di bahan pangan dapat diketahui dengan menghitung
persentase yang tersisa setelah semua komponen lain telah diukur total carbohydrate by difference, yaitu dengan persamaan 1.1 SNI 01-2891-1992:
1.1 Metode by difference ini masih digunakan oleh FDA, tetapi metode ini dapat menghasilkan
nilai yang salah karena ada kemungkinan terjadi akumulasi kesalahan dari metode-metode yang digunakan untuk mengukur komponen lain, dan kemungkinan adanya komponen non karbohidrat
yang terukur sebagai karbohidrat menyebabkan penyimpangan yang lebih besar. Pengukuran kadar karbohidrat secara langsung lebih baik karena didapat hasil lebih yang akurat.
2.3.2.1. Analisis karbohidrat langsung
Metode yang telah dikembangkan untuk analisis karbohidrat sangat banyak, dan tergantung juga oleh jenis analisis kuantitatif atau kualitatif dan tipe karbohidrat yang dianalisis. Sehingga
metode pengukuran karbohidrat sangat beragam mulai dari metode kromatografi dan elektroforesis Kromatografi Lapis Tipis, Kromatografi Likuid Kinerja Tinggi dan Kromatografi Gas; metode
kimia metode titrasi Lane Eynon, metode gravimetri Munson Walker, metode Luff Schoorl, metode kolorimetri seperti anthrone sulfat dan fenol sulfat; metode enzimatis; metode fisik
polarimetri, indeks refraktif, densitas dan infra merah serta metode immunoassay.
7
Uji karbohidrat yang resmi ditetapkan oleh BSN dalam SNI 01-2891-1992 yaitu analisis total karbohidrat dengan menggunakan metode Luff Schoorl. Pada tahun 1936 International
Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis mempertimbangkan Metode Luff-Schoorl sebagai salah satu metode yang digunakan untuk menstandarkan analisis gula pereduksi karena
metode Luff Schoorl saat itu menjadi metode yang resmi dipakai di pulau Jawa, di samping nominator lainnya yaitu metode Lane-Eynon. Tetapi pada saat itu metode kolorimetri belum
banyak berkembang dan dalam catatan komisi itu terdapat agenda untuk melakukan penyeragaman analisis gula dengan metode kolorimetri.
Berikut ini adalah beberapa jenis analisis total karbohidrat langsung:
2.3.2.1.1. Analisis total karbohidrat dalam SNI 01-2891-1992
Seluruh senyawa karbohidrat yang ada dipecah menjadi gula-gula sederhana monosakarida dengan bantuan asam yaitu HCl dan panas. Monosakarida yang terbentuk kemudian dianalisis
dengan Metode Luff-Schoorl. Prinsip analisis dengan Metode Luff-Schoorl yaitu reduksi Cu
2+
menjadi Cu
1+
oleh monosakarida. Monosakarida bebas akan mereduksi larutan basa dari garam logam menjadi bentuk oksida atau bentuk bebasnya. Kelebihan Cu
2+
yang tidak tereduksi kemudian dikuantifikasi dengan titrasi iodometri SNI 01-2891-1992.
Reaksi yang terjadi 1.2: Karbohidrat kompleks
→ gula sederhana gula pereduksi Gula pereduksi+ 2 Cu
2+
→ Cu
2
Os 2 Cu
2+
kelebihan + 4 I
-
→ 2 CuI
2
→ 2 CuI
-
+ I
2
I
2
+ 2S
2
O
3 2-
→ 2 I
-
+ S
4
O
6 2-
1.2 Osborne dan Voogt 1978 mengatakan bahwa Metode Luff-Schoorl dapat diaplikasikan untuk
produk pangan yang mengandung gula dengan bobot molekuler yang rendah dan pati alami atau modifikasi.
Kemampuan mereduksi dari gugus aldehid dan keton digunakan sebagai landasan dalam mengkuantitasi gula sederhana yang terbentuk. Tetapi reaksi reduksi antara gula dan tembaga
sulfat sepertinya tidak stoikiometris dan sangat tergantung pada kondisi reaksi. Faktor utama yang mempengaruhi reaksi adalah waktu pemanasan dan kekuatan reagen. Penggunaan luas dari metode
ini dalam analisis gula adalah berkat kesabaran para ahli kimia yang memeriksa sifat empiris dari reaksi dan oleh karena itu dapat menghasilkan reaksi yang reprodusibel dan akurat Southgate
1976.
8
2.3.2.1.2.
Analisis total karbohidrat dengan Metode Anthrone sulfat
Penggunaan Metode Anthrone untuk analisis total karbohidrat mulai berkembang sejak penggunaan pertama kali oleh Dreywood pada tahun 1946 untuk uji kualitatif. Dasar dari reaksi ini
adalah kemampuan karbohidrat untuk membentuk turunan furfural dengan keberadaan asam dan panas, yang kemudian diikuti dengan reaksi dengan anthrone yang menghasilkan warna biru
kehijauan Sattler dan Zerban 1948 dalam Brooks et al 1986. Anthrone, C
6
H
4
COC
6
H
4
CH
2
, adalah turunan dari anthraquinone. Senyawa ini diproduksi oleh reduksi katalitik dari anthraquinone oleh asam hidroklorat dengan keberadaan logam timah.
Senyawa ini mungkin ada dalam bentuk keto atau enol, yang masing-masing dikenal dengan nama anthrone and anthranol. Reaksinya dapat dilihat pada persamaan 1.3:
1.3
Mekanisme pembentukan warna anthrone dengan gula telah diteliti. Hurd dan Isenhour 1932 dan Wolfrom et al 1948 mempostulasikan bahwa karbohidrat dan turunannya mengalami
pembentukan cincin dalam keberadaan asam kuat dari mineral, seperti yang ditunjukkan untuk glukosa 1.4:
1.4 Tiap tahap adalah pemecahan dari glukosaI menjadi 5-hydroxymethyl-2-furaldehydeIV
menunjukkan dehidrasi baik pada double bond atau pembentukan cincin. Wolfrom et al. 1948 menunjukkan bukti spektroskopik untuk senyawa intermediate II dan III pada reaksi ini Sattler
9
and Zerban 1948 menyarankan bahwa pembentukan warna hijau pada reaksi anthrone tergantung oleh keberadaan 5-hidroksimetil-2-furaldehid, atau senyawa furfural yang mirip, yang dibentuk
oleh reaksi asam sulfat pada karbohidrat. Momose et al. 1957 melakukan kromatografi pada ekstrak benzene dari pewarna terhadap
alumina dan menunjukkan bahwa bagian yang dapat larut dari benzene-terdiri dari beberapa pewarna yang memberikan pewarnaan yang berbeda dengan asam sulfat. Mereka menentukan
berat molekul dari salah satu pewarna utama yaitu kurang lebih 530, dan mempostulasikan formula dari pewarna itu C
47
H
30
O
3
. Mereka menyimpulkan bahwa 3 mol anthrone bereaksi dengan 1 mol glukosa, yang digambarkan dalam persamaan 1.5:
3C
14
H
10
O + C
6
H
12
O
6
C
47
H
3
O
30
+ 5H
2
O + CH
2
O 1.5
Dari data analisis dan spektrum inframerah dari pewarna, dan mekanisme reaksinya dipertimbangkan,
mereka menduga
struktur yang
mungkin adalah
1,2,5,- atau
1,3,5,-trianthronylidenepentane. Ludwig dan Goldberg 1956 melaporkan adaptasi dari Metode Anthrone kolorimetri untuk
analisis total karbohidrat secara kuantitatif pada pangan. Metode yang digunakan relatif cepat dan akurat serta lebih baik daripada metodologi analisis karbohidrat sebelumnya, yaitu metode
Somogyi-Shaffer-Hartmann yang menggunakan teknik teknik iodometri dan prinsip gula pereduksi. Mereka menunjukkan bahwa persiapan hidrolisis dan deproteinisasi tidak perlu
dilakukan ketika teknik anthrone digunakan. Uji Anthrone ini memiliki kelebihan dalam hal sensitifitas dan kesederhanaan ujinya
Koehler 1952.Sejumlah kecil karbohidrat dapat memberikan warna yang terdeteksi dengan menggunakan spektrofotometer. Dreywood 1946 melakukan uji spesifisitas dari reaksi dan
membuat daftar 18 jenis karbohidrat, termasuk beberapa turunan selulosa, yang memberikan hasil positif. Dia juga melaporkan hasil negatif terhadap kelompok besar nonkarbohidrat, termasuk
sejumlah resin sintetik nonselulosa, asam organik, aldehid, fenol, lemak, terpena, alkaloid, dan protein. Nonkarbohidrat yang menunjukkan hasil positif hanya furfural, tetapi hasil positif ini
cepat menghilang karena warna hijau dikaburkan oleh presipitat coklat. Morris 1948 juga menunjukkan spesifisitas anthrone untuk karbohidrat sangat tinggi, dan dia melaporkan reaksi
positif untuk semua mono-, di-, dan polisakarida murni yang diujikan, juga sampel of dekstrin, dekstran, pati, polisakarida tumbuhan dan gum, polisakarida tipe II dan II dari pneumococcus,
glukosida, dan senyawa asetat dari mono-, di-, dan polisakarida.
10
Kekurangan dari Metode Anthrone adalah ketidakstabilan dari reagen anthrone yang dilarutkan dalam asam sulfat, sehingga perlu dilakukan persiapan reagen yang baru setiap hari.
Dreywood 1946 memperhatikan bahwa panas yang dihasilkan oleh pelarutan asam sulfat merupakan bagian yang penting dalam uji. Morris 1948 melihat signifikansi dari panas pada
reaksi anthrone dan menunjukkan bahwa pada sejumlah karbohidrat yang diberikan, intensitas warna bervariasi dengan jumlah panas yang dihasilkan. Oleh karena itu kurva standar juga perlu
dibuat setiap hari. Nilai total karbohidrat tidak dapat dinyatakan dalam persen karbohidrat, tetapi lebih baik
dinyatakan dengan istilah glucose equivalents per cent, karena kepekatan warna yang dihasilkan dari reaksi anthrone bervariasi dengan tipe gula yang ada. Kepekatan warna yang sama contohnya,
ditunjukkan oleh 100 µg. glukosa, 105 µg. maltosa, dan 111 µg glikogen. Gula murni lain selain glukosa dapat dikalkulasi dengan faktor konversi. Tetapi jika terdapat campuran karbohidrat yang
tidak diketahui pada bahan pangan faktor konversi itu tidak dapat digunakan, dan hasilnya bukan persentase karbohidrat absolut, melainkan ekuivalen glukosa, yang dapat bervariasi dari nilai
persentasi karbohidrat yang sebenarnya dengan jumlah yang tidak dapat ditentukan. Keganjilan ini tidak signifikan ketika nilai glucose equivalents per cent digunakan hanya sebagai basis untuk
mengkonversi nilai total karbohidrat menjadi nilai total pangan Beck dan Bibby 1961. Untuk tujuan ini glucose equivalents per cent hanya sebagai indeks dari persentasi absolute dari
masing-masing karbohidrat dalam pangan.
2.4. Validasi dan Verifikasi Metode
