Produksi Fage Metode Penelitian Penelitian dilakukan melalui 3 tahap, meliputi:

3. METODE PENELITIAN 3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian ini telah dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi dan Biomedis Hewan; Laboratorium Biologi dan Nutrisi PPSHB-PAU; Laboratorium Fisiologi Kandang Tikus, Departemen Anatomi, Fisiologi, dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan IPB; Laboratorium Diagnostik Balai Besar Penelitian Veteriner Cimanggu dan Laboratorium Kesehatan Daerah Bogor. dari bulan April 2011- April 2012. 3.2 Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah fage FR38 dan Salmonella P38, media pengkayaan, agar lapis ganda, makanan tikus, sosis, susu dan bahan-bahan untuk analisa pangan dan bakteri. Alat yang digunakan adalah, cawan petri, jarum ose, refrigerator, alat-alat untuk analisa bakteri dan fage, alat analisa nutrisi dan pengolahan untuk sosis, susu, dan air serta alat-alat untuk pemeliharaan, pengambilan dan analisa organ tikus.

3.3 Metode Penelitian Penelitian dilakukan melalui 3 tahap, meliputi:

3.3.1 Produksi Fage

Metode yang digunakan dalam memproduksi fage adalah kombinasi dari metode Clokie dan Kropinski 2009 dan Budiarti et al. 2011.

3.3.1.1 Pengkayaan Fage FR38

Peremajaan Salmonella P38: 1 loup bakteri Salmonella P38 digoreskan pada media agar miring SS secara aseptik, kemudian diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Pengkayaan Fage: Koloni tunggal isolat Salmonella P38 diinokulasikan ke dalam media Nutrient Broth NB lalu diinkubasikan di dalam Waterbath Shaker Certomat WR dengan kecepatan 150-200 x g pada suhu 37 o C selama 24 jam sampai OD 600nm =1. Sebanyak 100 l kultur Salmonella P38 dicampurkan dengan supernatan fage FR38 100 l ke dalam tabung steril dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit. Campuran ditambahkan 5 ml soft agar yang bersuhu 47 o C, dituang pada media Nutrient Agar NA. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 o C selama 24 jam Atterburry et al. 2007. Pemurnian fage: Pemurnian fage dilakukan berdasarkan metode Goodridge et al. 2001 yang dimodifikasi pada kecepatan sentrifugasi 2800 x g. Plak dipindahkan dengan menggunakan pipet pasteur kemudian plak tersebut dicampurkan dengan 2-3 ml 25 pelarut Ringers atau SM. Suspensi fage divortex dan dibiarkan selama 5-10 menit pada suhu ruang. Suspensi tersebut kemudian disentrifugasi pada kecepatan 2800 x g, suhu 4 o C, selama 20 menit sebanyak 2 kali ulangan. Supernatan difiltrasi menggunakan membran filter milipore 0.22 m, kemudian supernatan disimpan untuk stok atau bahan produksi Clokie dan kropinski 2009.

3.2.1.2 Kuantifikasi Fage

Kuantifikasi fage diukur dengan cara menghitung jumlah plak yang terbentuk plaque forming units pfuml. Nilai pfuml ditentukan berdasarkan metode Foschino et al. 1995. Stok fage sebanyak 1 ml diencerkan sampai 10 7 , kemudian dari masing-masing pengenceran tersebut diambil 100 l ditambahkan 100 l Salmonella P38 yang telah diinkubasi selama 3-4 jam pada media NB. Suspensi diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37 o C. Sebanyak 5 ml soft agar yang masih bersuhu 42 o C dicampurkan, selanjutnya dituang ke media NA, kemudian diinkubasi pada 37 o C selama 24 jam. Zona bening plak yang terbentuk dihitung setelah diinkubasi selama 24 jam Clokie dan kropinski 2009. Rumus jumlah fage: 3.2.1.3 Efisiensi Lisis Fage FR38 Efektifitas lisis sel Salmonella P38 oleh fage FR38 dilakukan berdasarkan metode Atterburry et al. 2007 yang dimodifikasi pada kecepatan sentrifugasi 2800 x g. Sebanyak 100 ml kultur bakteri Salmonella P38 yang telah ditumbuhkan di media NB sampai optical density OD 600nm = 1 dengan jumlah bakteri Salmonella P38 10 8 CFUml dibagi ke dalam dua tabung sentrifuge Fageml = Jumlah FagePlated X 1ml Plated X Faktor Pengenceran masing-masing sebanyak 50 ml, sentrifugasi dilakukan dengan sentrifuge Beckman pada kecepatan 2800 x g, suhu 4 C selama 30 menit dengan 3 kali ulangan. Supernatan dibuang, kemudian dibuat dua perlakuan yaitu kontrol pelet tanpa penambahan fage dan perlakuan pelet dengan penambahan 1 ml fage. Selanjutnya ditambahkan masing-masing 50 ml NB yang baru, kemudian dipindahkan ke dalam erlenmeyer dan dimasukkan ke dalam inkubator shaker dengan suhu 37 o C Clokie dan Kropinski 2009, masing-masing kultur diukur nilai OD-nya pada waktu ke-0, 30, 60, 90, 120 menit penetapan waktu pengamatan berdasarkan kombinasi dari penelitian Triana 1996 dan Pratiwi 2009. Pengukuran OD dilakukan dengan mengambil 1 ml sampel kemudian diencerkan dengan 4 ml NB lalu dibaca OD nya dengan spectrofotometer. 3.2.2 Pemanfaatan Fage Penelitian Tahap II bertujuan mengukur efisiensi fage litik dalam menurunkan cemaran mikroba pada pangan. Penelitian Tahap II ini meliputi langkah-langkah sebagai berikut: 1. Penentuan Sampel Sampel yang akan diberi perlakuan adalah susu dan sosis. 2. Penentuan Perlakuan Penentuan perlakuan kombinasi fage litik yang ditambahkan dilakukan berdasarkan penelitian terdahulu yaitu Pratiwi 2009 menggunakan perlakuan 100 l fage litik terhadap 100l E. coli resistent antibiotic ternyata efektif menurunkan jumlah E. coli resistent antibiotic dan Triana 1996 menggunakan perlakuan 1,5 ml fage litik terhadap 5 ml Xanthomonas campestris pv glycines ternyata efektif menurunkan Xanthomonas campestris pv glycines. Perlakuan dari penelitian adalah rentang dari kedua penelitian diatas, yaitu: a Perlakuan Fage FR38 dan b Kontrol

3.2.2.1 Pengolahan Susu dengan Aplikasi Fage

Pengolahan susu dengan aplikasi fage litik dirancang dengan cara mengkombinasikan suhu pasteurisasi Brennan 2004 dengan aplikasi penambahan fage litik. Prosedur penelitian diuraikan pada Gambar 10 berikut. Efektifitas pemanfaatan Fage litik pada susu diukur dengan cara mengkombinasikan aplikasi penambahan fage litik pada susu pasteurisasi yang diberi cemaran 4.3 x 10 4 cfu Salmonella P38 dan ditambahkan fage FR38 sebanyak 3.8 x 10 4 pfu fage100 ml susu. Gambar 10. Prosedur pengolahan susu dengan aplikasi fage litik

3.2.2.2 Pengolahan Sosis dengan Aplikasi Fage

Pengolahan sosis dengan aplikasi fage litik dirancang dengan cara mengkombinasikan prosedur Essien 2003 dengan aplikasi penggunaan fage litik. Prosedur penelitian diuraikan pada Gambar 11 berikut. Efektifitas fage litik pada sosis diukur dengan cara mengkombinasikan aplikasi penggunaan fage litik pada sosis sapi olahan yang diberi cemaran 4.7 x 10 4 cfu Salmonella dan 3.8 x 10 pfu fage20 g sosis. SUSU HASIL PEMERAHAN PENYARINGAN PENGUMPULAN PASTEURISASI 85-95 C SELAMA 1-2 MENIT LALU DIDINGINKAN PADA SUHU RUANG TANPA PEMBERIAN FAGE KONTROL PERLAKUAN FAGE PENGAMATAN WAKTU KONTAK 0, 24, 48 JAM SUSU Gambar 11. Prosedur pengolahan sosis dengan aplikasi fage litik

3.2.2.3 Pengolahan Air dengan Aplikasi Fage

Pengolahan air dengan aplikasi fage litik dilakukan dengan cara memberi perlakuan fage FR38 ke dalam aquades yang telah dicemari dengan Salmonella P38. Efektifitas fage litik pada air diukur dengan cara memberi perlakuan 3.4 x 10 4 pfu fage FR38 ke dalam 100 ml aquades yang telah dicemari dengan 4.8 x 10 4 cfu Salmonella P38. Pengamatan dilakukan pada selang waktu kontak 0, 24, dan 48 jam. DAGING 700g TANPA PEMBERIAN FAGE KONTROL PERLAKUAN FAGE PENGAMATAN WAKTU KONTAK 0, 24, 48 JAM PENGIKATAN SELONGSONG PEMBERSIHAN DAN PEMOTONGAN CURING DIGILING GARAM 25g ES BATU DAN MARGARIN DIADUK DISIMPAN SELAMA 24 JAM TAPIOKA 80g, GARAM 25g, GULA 10g, BAWANG PUTIH 10g, MERICA 10g, PALA 3g AIR 300g DIMASUKKAN DALAM SELONGSONG PEMASAKAN 70 O

C, 20 MENIT PENDINGINAN PADA SUHU RUANG

3.2.2.4 Pengamatan

Pengamatan dilakukan pada selang waktu kontak 0, 24, dan 48 jam waktu kontak ditentukan berdasarkan hasil penelitian Pratiwi 2009. Pengamatan meliputi total mikroba Salmonella P38 Harrigan 1998, serta analisa proksimat kandungan nutrisi pangan awal dan akhir yang meliputi kadar air AOAC 2004, kadar abu AOAC 2004, kadar lemak AOAC 2004, kadar protein AOAC 2004, prosedurnya adalah: 1. Kadar Air: sebanyak 1gram sampel ditimbang dalam cawan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 150 o C selama 8 jam, lalu ditimbang kadar airnya. Kadar air dihitung dengan rumus : Kadar air = Bobot sample segar-kering x 100 Bobot sample segar 2. Kadar Abu: sebanyak 1 gram sample ditempatkan dalam cawan porselen lalu dibakar sampai tidak berasap, kemudian diabukan di dalam tanur suhu 600 o C selama 2 jam dan ditimbang. Kadar Abu = Bobot Abu x 100 Bobot sample 3. Kadar Lemak Kasar: Sebanyak 2 gram sample disebar di atas kapas yang beralas kertas saring dan di gulung membentuk thimble, lalu dimasukkan ke dalam labu soxhlet, kemudian diekstraksi selama 6 jam dengan menggunakan pelarut lemak berupa heksan sebanyak 150 ml. Lemak yang terekstrak kemudian dikeringkan di dalam oven pada suhu 105 o C selama 1 jam. Kadar lemak dihitung dengan rumus berikut: Kadar lemak = Bobot lemak terekstrak x 100 Bobot sampel 4. Kadar protein: Sebanyak 0.25 gram sample, dimasukkan dalam labu Kjeldahl 100 ml, lalu ditambahkan selenium 0.25 gram dan 3 ml H 2 SO 4 pekat. Selanjutnya dilakukan destruksi pemanasan dalam keadaan mendidih selama 1 jam, sampai larutan jernih. Setelah dingin ditambahkan 50ml aquadest dan 20 ml NaOH 40, lalu didestilasi. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer yang berisi campuran 10 ml H3BO3 2 dan 2 tetes indikator Bromcresol Green-Methyl Red berwarna merah muda. Setelah volume hasil tampungan destilat menjadi 10 ml dan berwarna hijau kebiruan, destilasi dihentikan dan destilat dititrasi dengan HCL 0,1 N sampai berwarna merah muda. Perlakuan yang sama dilakukan juga terhadap blanko. Kadar Nitrogen total yang didapat dengan metode ini dihitung dengan rumus di bawah ini. Kadar protein diperoleh dengan mengalikan kadar Nitrogen dengan faktor perkalian untuk berbagai bahan pangan yang berkisar 5,18 – 6,38 AOAC, 1980. N = S-B x N HCL x 14 x 100 w x 1000 keterangan: S: volume titran sample ml B: volume titran blanko ml w: bobot sample kering mg. 5. Kadar Serat Kasar: Sebanyak 1 gram sampel dilarutkan dengan 100 ml H 2 SO 4 1.25, dipanaskan hingga mendidih lalu dilanjutkan dengan destruksi selama 30 menit, kemudian disaring dengan kertas saring dengan bantuan corong Buchner. Residu hasil saringan dibilas dengan 20 –30 ml air mendidih dan dengan 25 ml air sebanyak 3 kali. Residu didestruksi kembali dengan NaOH 1.25 selama 30 menit. Lalu disaring dengan cara seperti di atas dan di bilas berturut –turut dengan 25 ml H 2 SO 4 1.25 mendidih dan 25 ml air sebanyak tiga kali serta 25 ml alkohol. Residu dan kertas saring dipindahkan ke cawan porselen dan dikeringkan dalam oven 130 C selama 2 jam. Setelah dingin residu beserta cawan porselain ditimbang A, lalu dimasukkan dalam tanur 600 C selama 30 menit, didinginkan dan ditimbang kembali. Bobot serat kasar B = W – W W = bobot residu sebelum dibakar dalam tanur = A – bobot kertas saring + cawanA bobot residu + kertas saring + cawan W = bobot residu setelah dibakar dalam tanur = B – bobot cawanB bobot residu + cawan Kadar serat Kasar = Bobot serat kasar x 100 Bobot sample 6. Total mikroba dihitung dengan menggunakan metode permukaan dengan prosedur: agar steril terlebih dahulu dituangkan ke dalam cawan petri steril dan dibiarkan membeku. Setelah membeku dengan sempurna, 0.1 ml contoh yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar tersebut. Kemudian diratakan dengan menggunakan batang gelas melengkung hockey stick yang telah disterilkan dengan cara mencelupkan kedalam alkohol 95 dan dipijarkan sehingga alkohol habis terbakar. Jumlah koloni dihitung dengan rumus berikut: Jumlah koloni = jumlah koloni pada cawan x 1faktor pengenceran

3.2.3 Uji keamanan Secara In Vivo