d. Selama observasi 7 hari sebelum perlakuan tidak sakit, aktivitas dan
tingkah laku normal.
3.4.2 Kriteria eksklusi
Mencit tampak sakit ditandai dengan gerakan yang tidak aktif
3.5 Variabel Penelitian
1. Variabel bebas:
a. Ekstrak etanol kulit manggis
b. Monosodium Glutamate MSG
c. Vitamin E
2. Variabel tergantung:
a. Kadar serum enzim ALT dan AST dalam darah mencit jantan strain
DDW b.
Gambaran makroskopik hati: − Berat hati
− Perubahan warna hati − Konsistensi hati
− Permukaan hati c.
Tampilan histopatologi jaringan hati mencit dengan pewarnaan Hematoksilin eosin
d. Tampilan imunohistokimia TNF-α pada hati mencit
Universitas Sumatera Utara
3.6 Kerangka Konsep Penelitian
Gambar 3.1 Kerangka Alur Penelitian
3.7 Definisi Operasional
1. Mencit Mus musculus adalah anggota
muridae
tikus-tikusan yang berukuran kecil, sebagian besar mencit diperoleh dari peternak hewan
laboratorium untuk digunakan dalam penelitian biomedis, pengujian, dan pendidikan. Pada penelitian ini yang digunakan adalah mencit putih jantan
Mencit Aklimatisasi ± 1 minggu
Randomisasi dalam 4 kelompok
P0 n = 5 Aquadest
0,3mlgrBB 35 hari
P1 n = 5 MSG 8mggrBB
21 hari P3 n = 5
MSG 8mggrBB 21 hari +
Vit.E 0,2 mggrBB hari ke-22 sd 35
Terminasi
Yang dianalisa
:
Kadar serum AST ALT darah mencit
Makroskopik berat hati, konsistensi hati, perubahan warna hati dan permukaan hati mencit
Histopatologi hati mencit inti sel TNF-α
Jaringan Hati
P2 n = 5 MSG 8mggrBB 21 hari
+ Ekstrak kulit manggis 600 mggrBB
hari ke-22 sd 35
Universitas Sumatera Utara
strain DDW, umur 8 - 12 minggu, berat badan 25 - 30gr, yang berasal dari Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Universitas Sumatera
Utara.
2. Aklimatisasi merupakan suatu upaya penyesuaian
fisiologis
atau
adaptasi
dari suatu
organisme
terhadap suatu
lingkungan
baru yang akan dimasukinya. Hal ini didasarkan pada kemampuan organisme untuk dapat
mengatur
morfologi
, perilaku, dan jalur
metabolisme biokimia
di dalam
tubuhnya
untuk menyesuaikannya dengan lingkungan. Beberapa kondisi
yang pada umumnya disesuaikan adalah
suhu
lingkungan,
derajat keasaman
pH, dan kadar
oksigen
. Proses penyesuaian ini berlangsung dalam waktu yang cukup bervariasi tergantung dari jauhnya perbedaan kondisi antara
lingkungan baru yang akan dihadapi, dapat berlangsung selama beberapa
hari hingga beberapa minggu Rittner, 2005.
3. Randomisasi adalah
suatu metode untuk menempatkan subjek penelitian dalam uji klinis menjadi dua kelompok atau lebih secara acak random.
Satu kelompok menerima perawatan atau
obat
yang diteliti, dan satu kelompok menerima
plasebo
, obat lain, atau tidak menerima perawatan apa pun. Subjek penelitian akan dimasukkan ke dalam kelompok-kelompok
dengan berbagai metode.
Pada penelitian ini dibagi atas 4 kelompok perlakuan dengan masing- masing kelompok perlakuan:
A. Kelompok I P0: kelompok kontrol tanpa diberi MSG, Vitamin E dan
Ekstrak manggis, hanya diberi aquadest sebanyak 0,3 mlmencithari
Universitas Sumatera Utara
dengan cara dicekok menggunakan jarum oval gavage dari hari pertama sampai hari ke-35. Kemudian dilakukan pemeriksaan kadar
serum AST, ALT, serta makroskopik dan histopatologi hati. B.
Kelompok II P1: kelompok perlakuan yang diberi MSG 8 mggrBB setiap hari sebanyak 0,3mlmencithari dengan cara dicekok
menggunakan jarum oval gavage setiap hari selama 21 hari dan dilakukan pemeriksaan kadar serum AST, ALT serta makroskopik dan
histopatologi hati. C.
Kelompok III P2: kelompok perlakuan yang diberi MSG 8mgg berat badan setiap hari sebanyak 0,3mlmencithari dengan cara dicekok
menggunakan jarum oval gavage setiap hari selama 21 hari dan pada hari ke-22 sampai hari ke-35 dilanjutkan dengan pemberian Ekstrak
kulit manggis 0,2mgg BB selama 14 hari. Dilakukan pemeriksaan kadar serum AST, ALT serta makroskopik dan histopatologi hati.
D. Kelompok IV P3: kelompok perlakuan yang diberi MSG 8 mggrBB
setiap hari sebanyak 0,3mlmencithari dengan cara dicekok menggunakan jarum oval gavage setiap hari selama 21 hari dan pada
hari ke-22 sampai hari ke-35 dilanjutkan dengan pemberian pemberian vitamin E 0,2mggrBB selama 14 hari. Dilakukan pemeriksaan kadar
serum AST, ALT serta makroskopik dan histopatologi hati. Masing-masing dari setiap kelompok perlakuan P0, P1, P2, dan P3 diambil
secara acak 5 ekor mencit didekapitasi, kemudian perlakuan untuk menilai perubahan kadar serum AST dan ALT, makroskopik berat hati, konsistensi
Universitas Sumatera Utara
hati, permukaan dan perubahan warna hati mencit serta histopatologi dengan pewarnaan HE dan tekhnik pewarnaan immunohistokimia pada
hati mencit. 4
Ekstrak etanol kulit manggis adalah cairan yang berasal dari kulit manggis berwarna kuning kecoklatan tua yang telah diekstrakkan dengan etanol,
memiliki kandungan anti-oksidan yang tinggi di dalam kulit manggis yang merupakan senyawa kimia. Diberikan dengan dosis 600mgkgBB.
Pemberian dilakukan selama 14 hari dengan dicekok menggunakan jarum gavage. Kulit buah manggis didapatkan dari daerah pantai Gemi, Stabat,
Sumatera Utara. 5.
Monosodium Glutamate MSG, dengan rumus kimia C
5
H
8
O
4
NNaH
2
O adalah
garam natrium
dari
asam glutamat
yang merupakan salah satu
asam amino non-esensial
yang terbentuk secara alami yang mudah larut dalam air dan tidak berbau, dibuat melalui proses fermentasi dari tetes-gula
molases oleh coryneform bacteria. Dari fermentasi ini dihasilkan asam glutamat. Asam glutamat kemudian ditambah soda natrium karbonat,
sehingga terbentuk Monosodium Glutamate MSG, kemudian dimurnikan dan dikristalisasi, sehingga merupakan serbuk kristal murni
merupakan bahan tambahan yang diberikan untuk mempertegas rasa dan aroma
Ninomiya, 1998. Dosis yang diberikan adalah 8 mggrBB. Pemberian dilakukan selama 21 hari dengan dicekok menggunakan jarum gavage.
Pada penelitian ini menggunakan Ajinomoto 29 gr BPOM RI
Universitas Sumatera Utara
MD245813034037, diproduksi oleh PT Ajinomoto Indonesia, Mojokerto 61352- INDONESIA.
6. Vitamin E merupakan anti-oksidan non-enzimatis yang mampu
mendonorkan ion hidrogen dan dapat mengubah radikal peroksil menjadi radikal tokoferol yang kurang reaktif sehingga tidak mampu menyerang
rantai asam lemak. Dosis yang diiberikan adalah sebanyak 0,2mgkgBB, dengan nama DL-A-TOCOPHERYL ACETATE, nomor produk: 0420085,
lot no.: UT08010021, no. analisis: 03614504 7.
Kadar serum ALT Alanin Transaminase adalah nilai enzim Alanin Transaminase ALT merupakan enzim yang terdapat di hati yang diukur
dengan dimention clinical system alat penganalisa otomatis sesuai dengan metode IFCC, Bergmeyer 1986 dalam Pratiwi 2006.
Penghitungan ALT dilakukan dengan rumus 1746 x Δ A Hg nmmenit
dengan satuan UL. 8.
Kadar serum AST aspartate transaminase, adalah nilai enzim Aspartat Transaminase AST merupakan enzim yang terdapat di hati yang diukur
dengan dimention clinical system alat penganalisa otomatis sesuai dengan metode IFCC dan metode ALT yakni Bergmeyer 1986 hanya
pereaksinya yang berbeda. Penghitungan AST dilakukan dengan rumus 1746 x Δ A Hg nmmenit dengan satuan UL.
9. Gambaran makroskopis hati mencit yaitu penilaian yang dilakukan secara
kasat mata dengan melihat, menimbang dan memegang organ hati, dan dilakukan pengukuran terhadap berat organ hati awal mencit antara
Universitas Sumatera Utara
kelompok mencit kontrol dengan kelompok mencit yang mendapat perlakuan termasuk diantaranya: perbandingan perubahan warna hati dari
coklat kemerahan menjadi pucat atau coklat tua, konsistensi hati kenyal dan padat menjadi lembek sampai rapuh dan struktur permukaan yang
licin menjadi bernodul atau ada lesi. Pengamatan makroskopis hati meliputi berat, warna, konsistensi dan permukaan hati yang normal
berwarna merah kecoklatan, dan konsistensinya kenyal serta permukaan yang licin. Dewi, 2010. Berikut ini adalah kriteria penilaiannya yaitu:
− Kriteria abnormal bila ditemukan: a.
Perubahan berat organ hati b.
Perubahan warna c.
Perubahan konsistensi d.
Perubahan permukaan − Derajat kerusakan hati:
0 = Tidak terjadi perubahan +1 = Jika ditemukan 1 dari kriteria di atas
+2 = Jika ditemukan 2 dari kriteria di atas +3 = Jika ditemukan 3 dari kriteria di atas
10. Gambaran histopatologi hati adalah gambaran kerusakan hati secara
mikroskopis yang dinilai dengan mengukur derajat kerusakan berupa nekrosis dari sel-sel hati. Nekrosis adalah kematian akibat terpapar
stimulus eksogen seperti zat-zat kimia sehingga terjadi perubahan morfologi sel yang mati berupa hancurnya inti dengan pecahan-pecahan
Universitas Sumatera Utara
kromatin karyoreksis penyusutan inti sel dengan batas yang tidak teratur dan berwarna gelap karyopiknosis, dan hancurnya inti karyolisis Price
and Wilson, 2006. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop cahaya dengan merek Olympus dengan pembesaran dimulai dari 40x, 100x dan
400x, luas nekrosis pada hati mencit dinilai secara semikuantitatif menggunakan mikroskop cahaya pada zona 3 dalam 10 lobulus. Skor
nekrosis sentrilobular dibedakan atas 5 derajat. Sawant et al., 2004.
Tabel 3.1 Skor nekrosis sentrilobular.
Kriteria Nekrosis Sentrilobular Skor
Tidak ditemukan nekrosis Nekrosis minimal
1 Ringan 13 lobulus mengalami nekrosis
2 Sedang 13 – 23 lobulus mengalami nekrosis
3 Berat 23 lobulus mengalami nekrosis
4 Nekrosis massif
5
11. TNF-α merupakan
sitokin mediator utama yang berperan di dalam proses inflamasi akut untuk mengaktivasi endothelial lokal menampilkan
molekul adhesi, menimbulkan demam, menyebabkan nyeri, anoreksia, hipotensi, dan penurunan permeabilitas pembuluh darah shok Robin and
Cotran, 2010
,
sebagai biomarker peradangan dan sebagai indikator penting untuk intervensi terapi Shoelson, 2006. Pemeriksaan TNF-
α menggunakan tehnik pemeriksaan tampilan pewarnaan imunohistokimia
dengan nama antibodi TNF- α NBP1-67821, pAb, PT. Novusbio
Biologicals, 0.05 mg, konsentrasi 1 mgmL, pengenceran 1: 50-100,
Universitas Sumatera Utara
penyimpanan pada suhu -20 C, dapat digunakan untuk pemeriksaan
ELISA, ICCIF, IHC, IHC-P. Jaringan hati yang telah dipotong secara serial, diwarnai dengan tampilan pewarnaan imunohistokimia TNF-
α dan diamati di bawah mikroskop cahaya, dengan pembesaran mulai 40x, 100x
dan 400x. Penilaian tampilan pewarnaan imunohistokimia TNF- α adalah
sebagai berikut: − Kontrol positif digunakan jaringan yang berasal dari kolon yang
terdiagnosa sebagai karsinoma kolon, fungsinya sebagai pembanding warna tampilan coklat yang terwarnai pada hasil pemeriksaan
imunohistokimia. − Positif bila tertampil warna coklat pada membran sitoplasma.
− Hasil pewarnaan imunohistokimia adalah perkalian antara intensitas tampilan warna coklat dengan luas tampilan pewarnaan
imunohistokimia, dimana:
− Intensitas tampilan: = Tidak tertampil warna coklat negatif
1 = Tampilan warna coklat yang tertampil lemah 2 = Tampilan warna coklat yang tertampil sedang
3 = Tampilan warna coklat yang tertampil kuat − Luas tampilan:
1 = Luas tampilan warna coklat yang tertampil seluas 25
2 = Luas tampilan warna coklat yang tertampil seluas 25- 50
3 = Luas tampilan warna coklat yang tertampil seluas 50
Universitas Sumatera Utara
− Hasil perkalian antara intensitas tampilan warna coklat dengan luas
tampilan pewarnaan imunohistokimia yang diberi skor:
0 = tampilan negatif 1 - 3 = tampilan lemah
4 - 6 = tampilan sedang 7 - 9 = tampilan kuat
3.8 Etika Penelitian
Kategori