Etika Penelitian Analisis Data

− Hasil perkalian antara intensitas tampilan warna coklat dengan luas tampilan pewarnaan imunohistokimia yang diberi skor: 0 = tampilan negatif 1 - 3 = tampilan lemah 4 - 6 = tampilan sedang 7 - 9 = tampilan kuat

3.8 Etika Penelitian

Penggunaan dan penanganan hewan di laboratorium penelitian dilakukan sesuai dengan aturan etika penelitian hewan yang diatur dalam deklarasi Helsinki dan telah diperoleh “Ethical clearance” dari komite etik Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam MIPA Universitas Sumatera Utara. Medan.

3.9 Bahan dan Alat Penelitian

Bahan -bahan yang dibutuhkan dalam penelitian a. Pericarp bagian dalam kulit manggis telah dideterminasi di Herbarium Medanense MEDA jurusan biologi Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam MIPA Universitas Sumatera Utara, dan diekstrakkan di Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Hewan coba mencit jantan strain DDW umur 8-12 minggu dan berat badan 25-30gr, berasal dari Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam MIPA Universitas Sumatera Utara. b. Pakan standar mencit berupa pellet produksi PT. Chaevron Pokphan Medan dicampur jagung halus dengan perbandingan 2 : 1. Universitas Sumatera Utara c. Reagensia untuk pengukuran kadar enzim ALT alanin transaminase Reagent A Enzim reagent Tris buffer, pH 7.15 137.5 mmoll, L-Alanine 700 mmolL, LDH 1650 UL, NaN 3 0.1. Reagent B substrat 2- Oxoglutarate 82.5 mmolL, NADH 1.0 mmolL, NaN 3 0,1. d. Reagensia untuk pengukuran kadar enzim AST aspartate transaminase: Reagent A Enzim reagent Tris buffer, pH 7.8 110 mmoll, L-Aspartate 325 mmoll, LDH 810 UI, MDH 810 UL, NaN 3 0,1 . Reagent B Substrat 2-Oxoglutarate 65 mmolL, NADH 1.0 mmolL, NaN 3 0.1. Peralatan yang dibutuhkan dalam penelitian • Kandang mencit dan perlengkapannya • Jarum gavage untuk cekok tikus, timbangan, sekam padi. • Seperangkat alat pengukuran kadar AST dan ALT yaitu: pipet 20-200 µL, pipet 100-1000µL, cup serum, tabung ependorf, dan sentrifuse. • Seperangkat alat pemeriksaan makroskopis dan pemeriksaan dengan tekhnik imunohistokomia • Timbangan tikus, gelas arloji, spuit 1 ml, bak bedah dan dissecting set, • Cawan petri, batang pengaduk, handscoen, masker, kertas milli. • Mikroskop binokuler dengan merek Olympus CX21 3.10 Pelaksanaan penelitian 3.10.1 Persiapan dan pemeliharaan hewan mencit Mencit dipelihara dalam kandang plastik ukuran 30 x 20 x 10cm dengan anyaman kawat sebagai penutup, dasar kandang dilapisi sekam padi setebal 0,5- Universitas Sumatera Utara 1cm dan diganti setiap tiga hari, ditempatkan dalam ruangan yang memiliki ventilasi dan mendapat cahaya matahari secara tidak langsung. Kandang tempat makan dan minum mencit dibersihkan setidaknya tiga kali dalam seminggu. Sebelum perlakuan, mencit diaklimatisasi selama seminggu. Pemberian makan dan minum dilakukan setiap hari secara ad libitum. Pakan yang diberikan berupa pellet c-0,5 produksi PT.Chaevron Pokphan Medan dan aquades. Cahaya ruangan, kelembaban ruangan dan suhu berada pada kisaran alamiah. Sampel yang terdiri dari 20 ekor mencit dibagi secara acak dalam 4 kelompok, masing-masing kelompok 5 ekor. Tiap kelompok diberi kode kelompok I, II, III, dan IV. Perlakuan diberikan sesuai dengan kelompok. Pakan diberikan setelah perlakuan dilakukan berupa pellet yang dicampur jagung halus dengan perbandingan 2 : 1 diberikan secara ad libitum setiap pagi hari jam ± 10.00-11.00 WIB sebanyak 0,5-0,7 grharimencit serta air minum dari ledeng PAM, Perusahaan Air Minum

3.10.2 Prosedur pembedahan hewan mencit

Prosedur pembedahan dilakukan melalui tahap persiapan, pembedahan dan sanitasi. Pada tahap persiapan, disiapkan pot yang sudah diberi label sesuai dengan nomor perlakuan mencit yang akan dilakukan pembedahan. Pot organ diisi dengan formalin buffer 10 untuk menyimpan organ. Disiapkan spuit insulin 1 ml yang sudah diberi label. Disiapkan peralatan bedah seperti gunting bedah, pinset, gelas arloji, cawan petri, papan bedah, pins, beker glas. Tahap pembedahan, mencit dibunuh secara neck dislocation. Mencit diposisikan pada papan bedah menggunakan pins. Dibedah mulai dari bagian perut menggunakan Universitas Sumatera Utara gunting bengkok. Darah langsung diambil dari jantung, masukkan kedalam tempat penyimpanan berisikan es sebelum dibawa ke laboratorium dan organ hati diambil, dibersihkan dari kotoran yang menempel, dicuci dengan menggunakan NaCl 0,9 sampai bersih. Secara makroskopik, ditimbang berat dan ukuran hati mencit dan selanjutnya diamati perubahan warna, konsistensi dan permukaan pada hati, dimasukkan kedalam pot berisi formalin buffer 10. Tahap sanitasi dilakukan dengan cara memasukkan sisa organ mencit yang tidak terpakai dalam kantong plastik yang akan dibuang. Tempat kerja sisa melakukan pembedahan dibersihkan dan semua peralatan bedah yang terpakai dibersihkan. 3.10.3 Pembuatan Ekstrak Etanol Kulit Buah Manggis Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah kulit buah manggis, yang diperoleh dari desa pantai Gemi, Stabat, dari kebun penduduk desa. Kulit buah dibersihkan dari pengotor lalu dicuci hingga bersih, dikupas kulit buah terluar dan ditimbang. Diperoleh berat basah sebesar 10 kg. Selanjutnya kulit buah tersebut dikeringkan selama 7 hari dalam lemari pengering dengan temperatur ± 40 o C sampai kulit buah kering, didapat berat kering 2454,7 gr. Simplisia yang telah kering di blender menjadi serbuk lalu dimasukkan ke dalam wadah plastik bertutup dan di simpan pada suhu kamar. Kemudian serbuk ditimbang, maka diperoleh berat kering sebesar 2262,8 gr. Serbuk simplisia yang telah kering tadi kemudian dimasukkan ke dalam bejana tertutup sebanyak 2262,8 gr dan kemudian dibasahi dengan etanol 96, sampai semua serbuk terendam, biarkan selama lima hari sambil diaduk 3-4 kali sehari. Setelah itu massa dipindahkan ke dalam corong dan disaring dengan Universitas Sumatera Utara menggunakan kertas penyaring. Hasil penyaringan yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary evaporator. Kemudian dikeringkan selama lebih kurang 24 jam dan diperoleh ekstrak kental sebanyak 700 gr yang telah siap digunakan.

3.10.4 Prosedur pemeriksaan kadar enzim Alanin Transferase ALT dan

enzim Aspartate Transaminase AST Sampel darah mencit yang diambil langsung dari jantung dimasukkan ke dalam tempat penyimpanan spuit, yang telah dibilas dengan cairan heparin untuk mencegah pembekuan, kemudian: a. Spuit yang berisi sampel darah mencit di terima dan diberi “pelabelan” b. Sampel berlabel dari spuit dipindahkan ke tabung cuvet c. Sampel disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 10-15 menit untuk pemisahan serum dengan supernatant kedalam tabung ependrof. d. Dilakukan pengukuran terhadap kadar enzim ALT dan AST dengan menggunakan alat dimention clinical system

3.10.5 Prosedur pembuatan preparat histologi hati mencit

Sampel jaringan hati mencit diambil dan dicuci dengan NaCl fisiologis, kemudian difiksasi dengan larutan formalin buffer 10 0,1 molL phospat buffer saline pH 7, selama 6-48 jam. Kemudian dilakukan dehidrasi dengan menggunakan alkohol 70, 80, 96, dan alkohol absolut masing-masing 1 jam untuk pengeluaran air dari jaringan tersebut. Clearing atau penjernihan menggunakan xylol 1, 2 dan 3 selama 15 menit setelah itu dilakukan Impregnasi penyusupan parafin dengan parafin cair 1 dan 2 suhu 60-70 o C masing-masing Universitas Sumatera Utara selama 2 jam. Embedding parafinisasi yaitu pembuatan blok parafin dengan cara penanaman jaringan dalam kaset dan didinginkan, kemudian dilakukan proses sectioning pemotongan, dengan menggunakan mikrotom setebal 5 µm dan selanjutnya dimasukkan ke dalam wadah penampung atau waterbath. Kemudian dilanjutkan dengan proses mounting dengan meletakkan sediaan di atas objek gelas dan diolesi dengan glyserin. Proses terakhir adalah staining atau pewarnaan dengan hematoksilin eosin, tutup objek gelas dengan menggunakan deck glass dan entelan, kemudian diamati di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran mulai dari 40x, 100x dan 400x. Prosedur pewarnaan Hematoxylin Eosin Blok sediaan preparat yang telah diparafinisasi dicelupkan kedalam cairan xylol yang 1 dan xylol II, serta ke dalam alkohol 100, alkohol 95, dan alkohol 70, masing-masing selama 5 menit. Kemudian slide preparat dicuci dibawah air mengalir selama 3 menit. Dilanjutkan dengan perendaman slide preparat ke dalam larutan haematoksilin selama 5 menit. Cuci di bawah air mengalir selama 5 menit dan dilanjutkan ke dalam rendaman eosin selama 2-3 menit. Cuci kembali dengan air mengalir. Lalu dehidrasi dengan alkohol 80 dan alkohol 96 masing-masing selama 1 menit. Setelah itu dicelupkan kedalam larutan xylol 1, xylol II, xylol III masing-masing selama 1 menit, kemudian keringkan, teteskan cairan etelyne dan tutup dengan deck glass, slide preparat siap dinilai dan diamati di bawah mikroskop cahaya Olympus dengan pembesaran mulai dari 40x, 100x dan 400x. Universitas Sumatera Utara Prosedur pewarnaan Imunohistokimia Dilakukan deparafinisasi slide memakai 3 larutan Xylol 1,2 dan 3 masing- masing selama 5 menit, kemudian dilakukan proses rehidrasi untuk menghilangkan sisa xylol dengan menggunakan larutan alkohol absolut, alkohol 96, alkohol 80, dan alkohol 70 masing-masing selama 4 menit, kemudian dicuci dibawah air mengalir selama 5 menit. Masukkan slide ke dalam mesin pengering merk PT. Link Dako Epitope Retrieval, kemudian diatur set up Preheat 65 o C, running time 98 o C selama 15 menit, tunggu sampai ± 1 jam, setelah slide kering, dengan menggunakan spidol pap pen, preparat yang ada di slide dilingkari agar pada saat penetesan antibodi atau cairan lainnya tidak keluar melewati batas lingkaran pap pen tadi. Segera masukkan slide kedalam larutan Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 selama 5 menit, kemudian dilakukan blocking dengan peroxidase, selama 5-10 menit, kemudian kembali dicuci dalam larutan Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 selama 5 menit blocking kembali dengan Normal horse serum NSH 3, selama 15 menit, cuci dalam larutan Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 selama 5 menit. Setelah itu barulah diinkubasi dengan antibodi TNF- α NBP1-67821 pAb, dengan besar unit 0.05 mg, masing-masing selama 1 jam. Cuci kembali kedalam larutan Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 atau Tween 20 selama 5 menit, kemudian simpan kedalam rak slide dengan merk Dako Real Envision RabbitMouse selama 30 menit. Setelah itu slide kembali dicuci dalam larutan Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 atau Tween 20 selama 5-10 menit. Kemudian slide ditetesi dengan kromogen Diamino Benzidin DAB + Substrat Chromogen solution dengan pengenceran 20µL DAB : 1000 µL substrat dapat Universitas Sumatera Utara bertahan 5 hari di suhu 2-8 o C setelah di-mix selama 5 menit, di cuci kembali dengan air mengalir dan dilakukan pewarnaan dengan Hematoksilin masing- masing selama 10 menit. Cuci di bawah air mengalir selama 5 menit, celupkan slide preparat kedalam lithium carbonat 5 dalam aqua selama 2 menit, cuci dengan air mengalir dan kembali dilakukan proses pengeringan cairan sebelumnya dengan proses dehidrasi menggunakan alkohol 80, alkohol 96, alkohol Absolut masing-masing selama 5 menit, kemudian clearing dengan larutan Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3 masing-masing selama 5 menit, kemudian mounting dan tutup slide preparat dengan cover glass, dan preparat siap dilihat atau dinilai.

3.11 Analisis Data

Semua data dipresentasikan dalam bentuk rata-rata simpang baku rata- rata ± SD. Dilakukan uji normalitas dan homogenitas data. Jika data berdistribusi normal dan homogen dilakukan uji ANOVA. Bila terdapat perbedaan nyata dilanjutkan dengan uji Post Hoc analisa Benferroni taraf 5 untuk melihat perbedaan antara kelompok kontrol dari masing-masing perlakuan. Jika distribusi data tidak normal dan tidak homogen dilakukan transformasi data. Kemudian diuji lagi normalitas dan homogenitas data. Apabila masih tidak normal distribusinya dan data tidak homogen maka dilanjutkan dengan uji Mann Whitney untuk membandingkan antara dua kelompok perlakuan kontrol vs perlakuan. Pada kelompok data lebih dari dua kelompok maka dilakukan uji Friedman. Analisis data dilakukan dengan menggunakan sistem komputerisasi. Dalam penelitian ini, hanya rata-rata perbedaan p ≤ 0.05 yang dianggap bermakna signifikan. Universitas Sumatera Utara

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan didapatkan hasil pemeriksaan AST, ALT, kerusakan hati makroskopis, nekrosis sentrilobular dan tampilan TNF- α dengan pewarnaan imunohistokimia.

4.1.1 Hasil pemeriksaan kadar Serum Aspartate Transaminase AST

Pada gambar 4.1 dapat dilihat hasil pengukuran data AST setelah perlakuan pemberian MSG dan ekstrak etanol kulit manggis. Gambar 4.1 Kadar Serum Aspartate Transaminase AST mencit Mus musculus L.. Huruf kecil menunjukkan perbedaan pada masing-masing kelompok perlakuan P0 s.d. P3 adalah berbeda secara bermakna

a,b

p0,05. P0 = kontrol, P1 = MSG, P2 = MSG + Ekstrak etanol kulit manggis, P3 = MSG + Vitamin E. Kadar serum AST yang tertinggi terdapat pada kelompok P1 yang hanya mendapatkan MSG selama 21 hari 491,60 ± 141,58 mgdL, sedangkan kadar serum AST terendah terdapat pada kelompok P3 172,20 ± 32,75 mgdL yang a b a a Universitas Sumatera Utara