menggunakan kertas penyaring. Hasil penyaringan yang diperoleh dipekatkan dengan alat rotary evaporator. Kemudian dikeringkan selama lebih kurang 24 jam
dan diperoleh ekstrak kental sebanyak 700 gr yang telah siap digunakan.
3.10.4 Prosedur pemeriksaan kadar enzim Alanin Transferase ALT dan
enzim Aspartate Transaminase AST
Sampel darah mencit yang diambil langsung dari jantung dimasukkan ke dalam tempat penyimpanan spuit, yang telah dibilas dengan cairan heparin untuk
mencegah pembekuan, kemudian: a.
Spuit yang berisi sampel darah mencit di terima dan diberi “pelabelan” b.
Sampel berlabel dari spuit dipindahkan ke tabung cuvet c.
Sampel disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 10-15 menit untuk pemisahan serum dengan supernatant kedalam tabung ependrof.
d. Dilakukan pengukuran terhadap kadar enzim ALT dan AST dengan
menggunakan alat dimention clinical system
3.10.5 Prosedur pembuatan preparat histologi hati mencit
Sampel jaringan hati mencit diambil dan dicuci dengan NaCl fisiologis, kemudian difiksasi dengan larutan formalin buffer 10 0,1 molL phospat buffer
saline pH 7, selama 6-48 jam. Kemudian dilakukan dehidrasi dengan menggunakan alkohol 70, 80, 96, dan alkohol absolut masing-masing 1 jam
untuk pengeluaran air dari jaringan tersebut. Clearing atau penjernihan menggunakan xylol 1, 2 dan 3 selama 15 menit setelah itu dilakukan Impregnasi
penyusupan parafin dengan parafin cair 1 dan 2 suhu 60-70
o
C masing-masing
Universitas Sumatera Utara
selama 2 jam. Embedding parafinisasi yaitu pembuatan blok parafin dengan cara penanaman jaringan dalam kaset dan didinginkan, kemudian dilakukan proses
sectioning pemotongan, dengan menggunakan mikrotom setebal 5 µm dan selanjutnya dimasukkan ke dalam wadah penampung atau waterbath. Kemudian
dilanjutkan dengan proses mounting dengan meletakkan sediaan di atas objek gelas dan diolesi dengan glyserin. Proses terakhir adalah staining atau pewarnaan
dengan hematoksilin eosin, tutup objek gelas dengan menggunakan deck glass dan entelan, kemudian diamati di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran
mulai dari 40x, 100x dan 400x.
Prosedur pewarnaan Hematoxylin Eosin
Blok sediaan preparat yang telah diparafinisasi dicelupkan kedalam cairan xylol yang 1 dan xylol II, serta ke dalam alkohol 100, alkohol 95, dan alkohol
70, masing-masing selama 5 menit. Kemudian slide preparat dicuci dibawah air mengalir selama 3 menit. Dilanjutkan dengan perendaman slide preparat ke dalam
larutan haematoksilin selama 5 menit. Cuci di bawah air mengalir selama 5 menit dan dilanjutkan ke dalam rendaman eosin selama 2-3 menit. Cuci kembali dengan
air mengalir. Lalu dehidrasi dengan alkohol 80 dan alkohol 96 masing-masing selama 1 menit. Setelah itu dicelupkan kedalam larutan xylol 1, xylol II, xylol III
masing-masing selama 1 menit, kemudian keringkan, teteskan cairan etelyne dan tutup dengan deck glass, slide preparat siap dinilai dan diamati di bawah
mikroskop cahaya Olympus dengan pembesaran mulai dari 40x, 100x dan 400x.
Universitas Sumatera Utara
Prosedur pewarnaan Imunohistokimia
Dilakukan deparafinisasi slide memakai 3 larutan Xylol 1,2 dan 3 masing-
masing selama 5 menit, kemudian dilakukan proses rehidrasi untuk menghilangkan sisa xylol dengan menggunakan larutan alkohol absolut, alkohol
96, alkohol 80, dan alkohol 70 masing-masing selama 4 menit, kemudian dicuci dibawah air mengalir selama 5 menit. Masukkan slide ke dalam mesin
pengering merk PT. Link Dako Epitope Retrieval, kemudian diatur set up Preheat 65
o
C, running time 98
o
C selama 15 menit, tunggu sampai ± 1 jam, setelah slide kering, dengan menggunakan spidol pap pen, preparat yang ada di slide dilingkari
agar pada saat penetesan antibodi atau cairan lainnya tidak keluar melewati batas lingkaran pap pen tadi. Segera masukkan slide kedalam larutan Tris Buffered
Saline TBS pH 7,4 selama 5 menit, kemudian dilakukan blocking dengan peroxidase, selama 5-10 menit, kemudian kembali dicuci dalam larutan Tris
Buffered Saline TBS pH 7,4 selama 5 menit blocking kembali dengan Normal horse serum NSH 3, selama 15 menit, cuci dalam larutan Tris Buffered Saline
TBS pH 7,4 selama 5 menit. Setelah itu barulah diinkubasi dengan antibodi TNF-
α NBP1-67821 pAb, dengan besar unit 0.05 mg, masing-masing selama 1 jam. Cuci kembali kedalam larutan Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 atau Tween
20 selama 5 menit, kemudian simpan kedalam rak slide dengan merk Dako Real Envision RabbitMouse selama 30 menit. Setelah itu slide kembali dicuci dalam
larutan Tris Buffered Saline TBS pH 7,4 atau Tween 20 selama 5-10 menit. Kemudian slide ditetesi dengan kromogen Diamino Benzidin DAB + Substrat
Chromogen solution dengan pengenceran 20µL DAB : 1000 µL substrat dapat
Universitas Sumatera Utara
bertahan 5 hari di suhu 2-8
o
C setelah di-mix selama 5 menit, di cuci kembali dengan air mengalir dan dilakukan pewarnaan dengan Hematoksilin masing-
masing selama 10 menit. Cuci di bawah air mengalir selama 5 menit, celupkan slide preparat kedalam lithium carbonat 5 dalam aqua selama 2 menit, cuci
dengan air mengalir dan kembali dilakukan proses pengeringan cairan sebelumnya dengan proses dehidrasi menggunakan alkohol 80, alkohol 96, alkohol
Absolut masing-masing selama 5 menit, kemudian clearing dengan larutan Xylol 1, Xylol 2, Xylol 3 masing-masing selama 5 menit, kemudian mounting dan tutup
slide preparat dengan cover glass, dan preparat siap dilihat atau dinilai.
3.11 Analisis Data
