makin keluar. Selanjutnya campuran yang terdapat diatas objek gelas tadi difiksasi diatas bunsen yang menyala. Kemudian preparat ini diteteskan dengan zat warna
kristal violet diatas gelas objek hingga preparat tertutup, langkah ini dilakukan selama 1 menit. Setelah itu ditambahkan lugol diatas preparat tadi selama 1 menit. Preparat
kemudian dicuci dengan aquadestair kran diatas bak pewarnaan. Pencucian dilanjutkan dengan aceton alkohol selama 15 detik. Preparat kemudian dibilas sekali
lagi dengan aquadestair kran hingga bersih. Pewarnaan kemudian dilanjutkan dengan meneteskan safranin selama 15 detik pada preparat tersebut dan kemudian dibilas lagi
dengan aquadestair kran hingga bersih. Preparat yang telah dibilas kemudian dikeringkan, lalu ditetesi dengan minyak emersi dan siap untuk diamati dibawah
mikroskop dengan perbesaran 10x100 Carter 1984. Koloni Streptococccus sp. akan terlihat berbentuk bulat coccus, bergerombol membentuk rantai, berwarna ungu.
5.3 Uji Katalase
Uji ini dilakukan sebagai acuan untuk identifikasi bakteri yang
berkarakteristik dapat memproduksi enzim katalase. Langkah yang pertama yaitu
menyiapkan gelas objek atau cawan petri yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol 70 dan dikeringkan diatas api Bunsen. Pada gelas objek ini kemudian
diteteskan reagen H
2
O
2
3 sebanyak 1 tetes. Langkah berikutnya yaitu mengambil koloni bakteri yang telah tumbuh dari Blood Agar Plate BAP sebanyak 1 Öse dan
kemudian dicampurkan pada reagen H
2
O
2
tadi. Reaksi memberikan hasil positif apabila terbentuk gelembung-gelembung udara, sebaliknya reaksi memberikan hasil
negatif apabila tidak terbentuk gelembung. Bakteri Streptococcus sp. akan memberikan hasil berupa katalase negatif Lay 1994.
5.4. Uji Christie, Atkins, and Munch-Petersen CAMP
Uji CAMP dilakukan pada media agar darah. Koloni bakteri yang akan diuji adalah koloni bakteri yang telah dikultur ulang selama satu malam. Koloni S. aureus
diambil dengan öse, digoreskan vertikal ditengah-tengah media agar darah sehingga membagi agar darah menjadi dua bagian sama besar. Koloni Streptococcus diambil
dengan ose kemudian digoreskan horizontal di sebelah kanan dan kiri goresan Staphylococcus aureus
membentuk seperti garis tegak lurus. Jarak antara kedua goresan kira-kira 0.5 cm dari goresan Staphylococcus aureus. Setelah selesai, agar
darah diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37
ο
C. Uji positif akan menunjukan zona bening seperti anak panah arrow head diantara kedua goresan bakteri tersebut
Allen-Mierl et al. 2006.
5.5. Uji Serogrup S. agalactiae
S. agalctiae dari mastitis subklinis umumnya termasuk Grup-B. Identifikasi
dilakukan dengan menggunakan Streptococcal Grouping kit Oxoid
®
, England. Tiap isolat bakteri CAMP positif yang telah diremajakan pada media agar darah diambil 3-
5 koloni menggunakan öse secara aseptis, lalu dimasukan ke dalam tabung-tabung kecil ujung lancip bertutup ukuran 1 ml yang telah berisi ekstrak enzim streptococcal
masing-masing sebanyak 200 µl. Suspensi tersebut dipanaskan di dalam penangas air pada suhu 37
ο
C selama 10 menit. Setiap lima menit tabung-tabung tersebut dikocok. Langkah berikutnya suspensi diambil dengan pipet Pasteur lalu diteteskan sebanyak
dua tetes di atas kertas latex. Tambahkan latex reagen group B pada suspensi dan keduanya dicampurkan, dibiarkan selama 10-15 detik sambil diamati reaksi
aglutinasi yang terjadi.
5.6. Ekspresi Fenotipe SGB in vitro
Pengujian ekspresi fenotip dilakukan dengan menanam SGB pada media Soft Agar
SA dan media cair Todd Hewit Broth THB untuk diamati pola pertumbuhannya. Isolat SGB yang telah diremajakan pada media agar darah ditanam
secara aseptis sebanyak satu öse kedalam tabung reaksi yang berisi 5 ml media brain heart infusion
BHI broth. Suspensi diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37
ο
C, kemudian biakan segar diambil dengan öse dan diencerkan dalam 10 ml larutan NaCl
0.14 M. Langkah berikutnya, batang öse ujung lurus dimasukan kira-kira nya ke
dalam suspensi biakan segar SGB yang telah diencerkan, lalu ditanam kedalam 10 ml media soft agar SA. Setiap suspensi tersebut ditanam dalam dua media SA. Salah
satu dari media SA ditambahkan serum kelinci sebanyak 200 µl serum soft agar
SSA selanjutnya diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37
ο
C. Pengujian pola tumbuh pada media cair dilakukan dengan menanam 1 öse biakan segar SGB ke
dalam 10 ml media cair THB, kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 18-24 jam dan diamati pola pertumbuhannya Wibawan and Lämmler, 1990.
5.7. Uji Hemaglutinasi
Isolat S. agalactiae Group B SGB selanjutnya diuji hemaglutinasi menggunakan 1 eritrosit sapi perah dalam NaCl fisiologis. Pengujian hemaglutinasi
dilakukan dengan mencampur secara homogen 50 µl suspensi bakteri 10
8
selml dengan 50 µl eritrosit sapi perah ke dalam mikroplate. Reaksi hemaglutinasi dapat
dibaca jika kontrol eritrosit mengendap. Reaksi dikatakan positif apabila terjadi aglutinasi di dasar tabung dan negatif apabila terjadi endapan seperti pada kontrol
eritrosit Wahyuni dkk. 2005.
6. Orientasi Dosis Iradiasi Sinar Gamma SGB untuk LD
50
Isolat SGB terpilih yang mempunyai hemaglutinin positif Hn
+
ditumbuhkan dalam media BHI broth dan diinkubasi 37
o
C pada inkubator. Jika telah mencapai fase log dengan waktu pembelahan sel tertinggi pada kurva pertumbuhan perlakuan, lalu
bakteri dicuci memakai aquades steril 3 kali dengan sentrifus 10.000 rpm. Setelah pencucian, bakteri diencerkan menjadi 10
8
cfuml , lalu diiradiasi dengan dosis iradiasi
bertingkat dengan laju dosis 112,504 krad jam, di dalam iradiator Gamma chamber di PATIR, BATAN. Selanjutnya bakteri ditanam pada media BHI agar plat dan
diinkubasi di dalam inkubator 37
o
C selama 1 malam, lalu keesokan harinya koloni SGB yang tumbuh dihitung untuk menentukan nilai LD
50
bakteri SGB iradiasi yang
masih bertahan hidup sebanyak 50 sebagaimana penelitian terdahulu Tuasikal dkk. 2003.
7. Karakterisasi Protein Antigenik Permukaan SGB dengan SDS PAGE
Karakterisasi protein permukaan SGB iradiasi dilakukan dengan dua tahap, yaitu persiapan protein antigenik dan teknik SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate
Polyacrylamid Gel Electrophoresis untuk mengukur berat molekulnya Walker JM
2002. Protein antigenik diperoleh dari isolat SGB yang sudah ditanam dalam BHI
Broth dan diberi perlakuan iradiasi dengan dosis 0 dan 17 Gy, lalu disentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Pelet sel bakteri diambil kemudian
dicuci dengan NaCl fisiologis, selanjutnya diencerkan dengan NaCl fisiologis sampai volume 1,5 ml. Suspensi sel dimasukkan ke dalam tabung sonikator untuk memecah
dinding sel dan melepas protein. Sonikasi dilakukan selama tiga menit. Sel hasil sonikasi dipindahkan ke dalam tabung mini steril, kemudian disentrifuge pada 10.000
rpm selama 3 menit. Supernatan yang diperoleh dipisahkan dan disimpan pada suhu 0-4
o
C sampai akan digunakan dalam pengukuran konsentrasi protein menggunakan metode Bradford.
Penentuan berat molekul BM protein dianalisis dengan metode SDS PAGE. Pembuatan agar akrilamid dilakukan dengan bantuan dua lempeng kaca berukuran 13
x 15,5 cm Pharmacia - Biothec® yang telah dibersihkan dengan alkohol 70. Kedua lempeng kaca di himpit dan dijepit, serta diberi celah pada kedua sisi tepi bagian
dalam. Di bagian atas lempeng kaca disisipkan sisir pembuat jalur yang diisi gel pemisah 12 poliakrilamid sampai 1 cm di bawah ujung sisir dengan bantuan
mikropipet, lalu dibiarkan sekitar 60 menit, kemudian diisi gel pengumpul 4 poliakrilamid hingga mencapai permukaan lempeng kaca. Gel yang sudah dicetak
kemudian dibuka sisirnya, selanjutnya dipasang pada tangki elektroforesis, dan ditambahkan buffer elektroforesis Tris-glysin sampai gel terendam. Sumuran
dibersihkan sebelum digunakan dengan menyemprotkan bufer elektroforesis ke
dalamnya sehingga gel-gel yang tersisa di dalam sumuran dapat keluar. Setiap sumuran diisi dengan 10 µl campuran sampel protein dan sampel buffer yang sudah
dipersiapkan sebelumnya. Selain sampel digunakan juga marker protein sebagai penanda. Marker protein yang digunakan mempunyai berat molekul 25 sampai 225
kDa. Visualisasi berat molekul protein antigen dilakukan dengan perangkat elektroforesisi yang dihubungkan ke arus listrik pada tegangan 100 volt dengan arus
50 mA selama kurang lebih 3 jam sampai sampel buffer terlihat pada bagian bawah gel kurang lebih 1 cm di atas batas bawah gel. Elektroforesis dilakukan pada
kondisi suhu 4
o
C. Setelah elektroforesis berakhir, gel diangkat dari lempeng kaca dan direndam di dalam pewarnaan Commasie Brilliant Blue selama 30 menit pada suhu
ruang sambil diagitasi perlahan. Pewarna yang tidak terikat pada protein dihilangkan dengan merendam gel pada larutan pemucat metanol dan asam asetat sehingga gel
berwarna bening atau pita-pita protein telah terlihat jelas. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein dari garis awal gel pemisah
dengan jarak migrasi pewarna, atau dibandingkan terhadap pewarna marker.
8. Uji Patogenitas dan Imunitas dengan Hewan Model Mencit
Hewan model yang digunakan adalah mencit betina jenis Balb-C, berumur 8 minggu dengan bobot badan kira-kira 50 gram. Sebanyak 12 ekor mencit dibagi
dalam 4 kelompok perlakuan, yaitu kelompok vaksin V diberi SGB Hn
+
iradiasi, kelompok vaksin dan tantang VT diberi vaksin SGB Hn
+
iradiasi lalu ditantang dengan SGB Hn
+
tanpa iradiasi; kelompok tantang T diinfeksi dengan SGB Hn
+
tanpa iradiasi, dan kelompok kontrol K tanpa vaksin dan tanpa tantang. Bakteri yang diberikan mempunyai kepadatan 10
8
cfu ml. Vaksin SGB Hn+ iradiasi diinjeksikan dengan route intraperitoneal dengan dosis 0,3
– 0,4 cc ekor. Vaksin booster
diberikan setelah hari ke 7 dan ke 14, dan tantangan pada hari ke 21 post partus
. Infeksi tantang SGB Hn
+
tanpa iradiasi diberikan melalui parenteral tetes pada 5 pasang putting sebanyak 50 µl mencit. Suspensi bakteri tantangan diteteskan
di atas orificium externa puting susu mencit secara bertahap satu tetes sebanyak 5
