positif I tebentuknya lendir tipis, II terbentuk lendir lebih kental, dan III lendir sangat kental seperti massa gelatin. Sampel dengan kekentalan positif I, II dan III
dipakai sebagai sampel untuk kandidat yang dikultur pada agar darah Ruegg 2005.
4. Pemeriksaaan Mastitis Subklinis Secara Langsung
Uji dilakukan dengan metode Total Plate Count TPC. Pemeriksaan sampel susu terhadap jumlah total bakteri yang dapat ditemukan dalam media Plate Count
Agar PCA. Sebanyak 1 ml sampel susu dimasukkan ke dalam pengencer NaCl
fisiologis 9 ml, kemudian dihomogenkan selama 1 menit, campuran ini merupakan pengenceran ke-1 10
-1
. Sebanyak 1 ml pengenceran 10
-1
dipindahkan ke dalam 9 ml pengencer NaCl fisiologis pada tabung yang berbeda, dan campuran ini merupakan
pengenceran ke-2 10
-2
. Langkah ini terus dilakukan hingga pengenceran ke-6 10
-6
. Pada penelitian ini digunakan metode hitungan cawan dengan cara tuang
pour plate method. Sebanyak 1 ml dari masing-masing pengenceran tersebut di atas dipupuk di dalam cawan petri steril yang telah diberi label sesuai dengan urutan
pengenceran, kemudian ditambah dengan media PCA yang telah dicairkan sebanyak 18 ml suhu 45
C. Campuran dihomogenkan dengan membuat gerakan angka 8 pada cawan petri di tempat yang datar lalu didiamkan hingga memadat dan diinkubasi
didalam inkubator pada suhu 35 C selama 24-48 jam dengan posisi terbalik.
Pencatatan terhadap pertumbuhan koloni dilakukan setelah 48 jam pada setiap cawan yang mengandung 25-250 koloni. Langkah ini dilanjutkan dengan penghitungan
angka lempeng total dalam cawan tersebut dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni pada cawan sesuai dengan faktor pengenceran yang digunakan Lay 1994.
5. Identifikasi dan Isolasi S. agalactiae
Isolasi S. agalactiae berasal dari air susu yang menunjukkan reaksi CMT positif. Identifikasi terhadap keberadaan S. agalactiae berdasarkan morfologi koloni,
morfologi sel bakteri dengan pemeriksaan mikroskopis dan pewarnaan Gram, uji
katalase dan keberadaan faktor Christie, Atkins dan Muence Petersen CAMP pada media agar darah Quinn et al. 2006.
5.1. Pemeriksaan Morfologi Koloni Bakteri
Uji dilakukan pada media agar darah Blood agar plate BAP. Kultur bakteri pada
media BAP
dilakukan secara
aseptik untuk
mencegah terjadinya
pencemarankontaminasi pada media yang digunakan. Langkah pertama adalah memberikan label pada cawan-cawan petri yang telah berisi media Blood Agar Plate
BAP . Langkah berikutnya sampel susu kuartir diambil sebanyak 2 mata öse dan
digoreskan pada agar darah. Penanaman bakteri secara aseptis dilakukan dalam kabinet laminair flow dekat nyala api bunsen. Agar darah yang telah ditanami sampel
susu kuartir, lalu diinkubasi dalam inkubator selama β4 jam pada suhu γ7˚C.
Pengamatan dilakukan terhadap pertumbuhan koloni bakteri dan wilayah jernih di sekitar koloni hemolisis. Bakteri Streptococcus memiliki bentuk koloni-koloni bulat
halus, basah, cembung, terang tembus, dan menghemolisis sel darah merah. Hemolisis yang terjadi di sekeliling koloni bakteri dapat dibedakan menjadi tiga jenis,
yaitu hemolisis alpha α berupa hemolisis sebagian yang ditunjukkan dengan zona
kehijauan disekitar koloni; hemolisis beta berupa hemolisis komplit yang
ditunjukkan dengan zona bening di sekeliling koloni, dan hemolisis gamma yang
tidak menunjukkan perubahan warna di seputar koloni bakteri Quinn et al. 2006.
5.2. Pemeriksaan Mikroskopi
Untuk menunjang pemeriksaan mikroskopi maka dilakukan pewarnaan Gram. Langkah awal dari pewarnaan Gram adalah mempersiapkan preparat yang akan
diwarnai. Larutan NaCl fisiologis secukupnya diteteskan diatas gelas objek. Kemudian koloni bakteri sebanyak 1 Öse diambil dari media Blood Agar Plate BAP
dan dicampurkan bersama NaCl fisiologis diatas gelas objek tadi. Pencampuran ini dilakukan dengan cara menggerakkan Öse memutar dari arah dalam dan makin lama
makin keluar. Selanjutnya campuran yang terdapat diatas objek gelas tadi difiksasi diatas bunsen yang menyala. Kemudian preparat ini diteteskan dengan zat warna
kristal violet diatas gelas objek hingga preparat tertutup, langkah ini dilakukan selama 1 menit. Setelah itu ditambahkan lugol diatas preparat tadi selama 1 menit. Preparat
kemudian dicuci dengan aquadestair kran diatas bak pewarnaan. Pencucian dilanjutkan dengan aceton alkohol selama 15 detik. Preparat kemudian dibilas sekali
lagi dengan aquadestair kran hingga bersih. Pewarnaan kemudian dilanjutkan dengan meneteskan safranin selama 15 detik pada preparat tersebut dan kemudian dibilas lagi
dengan aquadestair kran hingga bersih. Preparat yang telah dibilas kemudian dikeringkan, lalu ditetesi dengan minyak emersi dan siap untuk diamati dibawah
mikroskop dengan perbesaran 10x100 Carter 1984. Koloni Streptococccus sp. akan terlihat berbentuk bulat coccus, bergerombol membentuk rantai, berwarna ungu.
5.3 Uji Katalase
Uji ini dilakukan sebagai acuan untuk identifikasi bakteri yang
berkarakteristik dapat memproduksi enzim katalase. Langkah yang pertama yaitu
menyiapkan gelas objek atau cawan petri yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol 70 dan dikeringkan diatas api Bunsen. Pada gelas objek ini kemudian
diteteskan reagen H
2
O
2
3 sebanyak 1 tetes. Langkah berikutnya yaitu mengambil koloni bakteri yang telah tumbuh dari Blood Agar Plate BAP sebanyak 1 Öse dan
kemudian dicampurkan pada reagen H
2
O
2
tadi. Reaksi memberikan hasil positif apabila terbentuk gelembung-gelembung udara, sebaliknya reaksi memberikan hasil
negatif apabila tidak terbentuk gelembung. Bakteri Streptococcus sp. akan memberikan hasil berupa katalase negatif Lay 1994.
5.4. Uji Christie, Atkins, and Munch-Petersen CAMP
Uji CAMP dilakukan pada media agar darah. Koloni bakteri yang akan diuji adalah koloni bakteri yang telah dikultur ulang selama satu malam. Koloni S. aureus
diambil dengan öse, digoreskan vertikal ditengah-tengah media agar darah sehingga membagi agar darah menjadi dua bagian sama besar. Koloni Streptococcus diambil
