f. Uji saponin. Uji kandungan saponin dilakukan dengan uji tabung dan uji
hemolisis. Pada uji tabung, serbuk daun M. tanarius dimasukkan sebanyak 0,5 g dalam tabung reaksi. Ditambahkan 10 mL air panas, didinginkan dan
kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Terbentuknya buih selama ± 10 menit setinggi 1 cm sampai 10 cm dan dengan penambahan 1 tetes
asam klorida 2N buih tidak hilang menunjukkan positif adanya saponin Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995. Untuk memastikan
kandungan saponin dalam daun M. tanarius dilakukan uji hemolisis. Sebanyak 40 µL ekstrak etanol daun M. tanarius yang dilarutkan dalam
aquadest diteteskan dalam lubang sumuran pada media BAP. Didiamkan selama satu hari kemudian diamati hasilnya. Bila area sekitar lubang
sumuran berubah warna menjadi kuning artinya terjadi proses hemolisis dan menunjukkan adanya kandungan saponin dalam ekstrak daun M. tanarius.
6. Uji antibakteri
a. Pembuatan suspensi bakteri S. pyogenes. Kultur murni bakteri S. pyogenes
yang didapatkan dari Balai Kesehatan Yogyakarta diambil sebanyak satu ose, di kultur pada media NB dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah
inkubasi, dibuat suspensi bakteri uji yang kekeruhannya disetarakan dengan larutan Mac Farland 0,5 untuk mendapatkan kepadatan populasi bakteri 1,5
x 10
8
CFU. b.
Pembuatan suspensi antibiotik sebagai kontrol positif. Antibiotik Amoxicilin dry syrup dilarutkan dalam aquadest steril hingga mendapatkan
konsentrasi 25 mgmL. Di-vortex hingga homogen terutama saat sebelum digunakan.
c. Pembuatan sumuran pada media NA. Media NA dituangkan dalam petri
kemudian didiamkan hingga memadat sebagai base layer. Media NA yang masih dalam bentuk cair diinokulasi dengan suspensi bakteri uji secara pour
plate, dituang dalam cawan petri yang telah terdapat base layer dan didiamkan hingga memadat sebagai seed layer. Dengan menggunakan
pelubang sumuran, media yang telah memadat tersebut dibuat lubang- lubang sumuran pada seed layer namun tidak menembus base layer. Jumlah
lubang yang dibuat sesuai dengan seri konsentrasi ekstrak etanol daun M. tanarius, kontrol negatif dan kontrol positif.
d. Uji daya antibakteri secara difusi sumuran. Pada lubang-lubang sumuran,
diberikan ekstrak yang telah dilarutkan dalam aquadest steril dengan variasi konsentrasi 5, 10, 20, 40, dan 80 50 mgmL, 100 mgmL, 200
mgmL, 400 mgmL, dan 800 mgmL sebanyak 40 µL. Kontrol positif yaitu suspensi antibiotik Amoxicilin dan kontrol negatif yaitu aquadest steril
sebagai pelarut ekstrak diberikan dalam lubang sumuran. Dilakukan inkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam, setelah waktu inkubasi diamati
hasilnya. e.
Penentuan KHM dan KBM dengan matode dilusi padat. Pada pengamatan hasil, dilihat zona hambat yang terbentuk disekitar sumuran. Setelah
mendapatkan zona hambat, range konsentrasi zona hambat digunakan untuk menentukan KHM dan KBM dengan metode dilusi padat. Variasi
konsentrasi dilusi padat dibuat berdasarkan konsentrasi terkecil yang masih memberikan zona hambat dari uji potensi antibakeri. Suspensi bakteri uji
dan ekstrak yang telah dilarutkan sesuai variasi konsentrasi diinokulasikan secara pour plate dalam media NA dengan perbandingan suspensi bakteri :
ekstrak 1 : 1. Diinkubasi dalam suhu 37˚C selama 24 jam. Hasil inkubasi
dilakukan penegasan hasil dengan melakukan streak pada media NA dan diinkubasi pada
suhu 37˚C selama 24 jam. Pada hasil streak diamati berdasarkan kekeruhan pertumbuhan bakteri pada media. Media yang jernih
tidak adanya pertumbuhan bakteri diberi notasi -, media yang keruh diberi notasi ++, dan sangat keruh +++. Konsentrasi terkecil yang menunjukkan
tidak adanya pertumbuhan bakteri selanjutnya dilakukan uji penegasan. f.
Uji penegasan. Media yang jernih dipilih dua konsentrasi terkecil untuk selanjutnya dilakukan uji penegasan. Permukaan media digores dengan ose,
kemudian digoreskan pada media yang masih steril. Adanya pertumbuhan bakteri pada bekas goresan menunjukkan pada konsentrasi tersebut terjadi
kemampuan penghambatan pertumbuhan bakteri sedangkan tidak adanya pertumbuhan bakteri menunjukkan pada konsentrasi tersebut terjadi
kemampuan membunuh pertumbuhan bekteri. Konsentrasi terkecil yang menunjukkan tidak adanya pertumbuhan bakteri ditentukan sebagai KBM,
sedangkan konsentrasi terkecil yang menunjukkan masih adanya pertumbuhan bakteri ditentukan sebagai KBM.
F. Analisis Hasil
