Gambar 23. Bentuk koloni bakteri S. pyogenes yang ditanam dalam
media BAP
Berdasarkan hasil identifikasi, bakteri S. pyogenes yang ditanam dalam media BAP secara streak plate membentuk warna putih keruh setelah diinkubasi
selama 24 jam Gambar 23, sedangkan media yang tidak ditanami bakteri tetap berwarna merah. Hal ini menunjukkan kemampuan hemolisis yang merupakan
ciri spesifik bakteri S. pyogenes. Bentuk koloni yang dihasilkan kokus berantai, kecil, bening, bulat, dan cembung dengan permukaan tidak mengkilap. Hal ini
menunjukkan bahwa bakteri yang didapatkan dari Laboratorium Balai Kesehatan Yogyakarta merupakan bakteri Streptococcus pyogenes.
G. Uji Potensi Antibakteri Ekstrak Etanol Daun M. tanarius terhadap
Bakteri S. pyogenes
Uji potensi antibakteri ekstrak etanol daun M. tanarius dilakukan dengan metode difusi sumuran. Ekstrak dilarutkan dalam aquadest steril dengan seri
konsentrasi 5, 10, 20, 40, dan 80 yang. Penentuan seri konsentrasi ekstrak mengacu pada penelitian yang sudah dilakukan oleh Lim, et al., 2009.
Dalam penelitian tersebut, digunakan ekstrak daun M. tanarius yang disari
menggunkan metanol 100 dengan konsentrasi ekstrak 1. Pada penelitian ini konsentrasi ekstrak yang digunakan dimulai dari konsentrasi 5. Perbedaan
metode pengeringan, ekstraksi dan jenis penyari dengan penelitian sebelumnya dapat memberikan hasil yang berbeda, oleh karena itu konsentrasi pada penelitian
ini ditingkatkan. Berdasarkan hasil orientasi, konsentrasi 80 adalah konsentrasi tertinggi ekstrak dapat larut dalam aquadest, sehingga konsentrasi 80 digunakan
sebagai konsentrasi tertinggi. Media yang digunakan dalam penelitian ini adalah media NA. Media NA
dipilih karena memiliki kandungan nutrisi yang lengkap bagi pertumbuhan bakteri. Kandungan nutrisi tersebut antara lain pepton, NaCl, yeast extract, dan
beef extract. Media ini dapat digunakan untuk berbagai jenis mikroorganisme Atlas, 1996. Pada penelitian ini digunakan kontrol negatif aquadest yang
merupakan pelarut ekstrak dan kontrol positif amoxicillin 25 mgml. Kontrol negatif digunakan untuk melihat apakah aquadest sebagai pelarut turut
memberikan pengaruh pada zona hambat yang terbentuk. Sedangkan kontrol positif yang digunakan Amoxicilin dipilih karena sering digunakan dalam
pengobatan kasus radang tenggorokan yang disebabkan oleh bakteri. Selain itu, menurut teori Amoxicilin dapat menghambat pertumbuhan bakteri S. pyogenes
Finch, Greenwood, Norrby, and Whitley, 2010. Antibiotik ini merusak lapisan peptidoglikan yang menyusun dinding sel bakteri Gram positif maupun Gram
negatif. Mekanisme kerjanya dengan mencegah ikatan silang peptidoglikan pada tahap akhir sintesis dinding sel, yaitu dengan menghambat protein pengikat
penisilin yang terlibat dalam penambahan asam amino yang berikatan dengan
peptidoglikan dinding sel bakteri dan mencegah aktivitas enzim transpeptidase yang membungkus ikatan silang polimer gula yang membentuk dinding sel
sehingga dinding sel menjadi rapuh dan mudah lisis Pratiwi, 2009. Dalam penelitian ini dilakukan replikasi sebanyak tiga kali, dari setiap
replikasi tersebut dilakukan repetisi tiga kali. Dari hasil pengamatan didapatkan zona hambat yang diukur menggunakan jangka sorong dengan satuan milimeter
mm. Pengukuran dilakukan secara vertikal, horizontal dan diagonal, kemudian dari tiga kali pengukuran tersebut hasilnya dirata-rata. Hasil pengukuran zona
hambat ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes disajikan secara lengkap dalam Lampiran 9.
Gambar 24. Hasil uji difusi ekstrak daun M. tanarius terhadap Streptococcus
pyogenes dengan metode difusi sumuran
Keterangan : A = Konsentrasi 80
B = Konsentrasi 40 C = Konsentrasi 20
D = Konsentrasi 10 E = Konsentrasi 5
+ = Amoxicilin 25mgml - = aquadest steril
Hasil pengukuran zona hambat ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes diringkas dalam Tabel IV.
Tabel IV. Hasil pengukuran zona hambat dalam milimeter mm Konsentrasi
Replikasi 1 Mean±SD
Replikasi 2 Mean±SD
Replikasi 3 Mean±SD
Total Mean±SD
5
13±0,81 12±0,05
12±0,18 12±0,84 a
10
14±0,95 13±0,68
14±0,24 14±0,50 a
40
18±0,53 17±0,43
18±1,40 18±0,28 b
Kontrol +
24±2,40 27±2,84
25±2,97 25±1.61 c
Kontrol -
6 6
6 6 d
Keterangan: Repetisi tiap replikasi sebanyak 3 kali
Diameter lubang sumuran 6 mm
Angka-angka yang diikuti oleh huruf sama, berbeda tidak bermakna berdasarkan uji T tidak berpasangan pada taraf p0,05
Berdasarkan data tersebut, zona hambat yang ditunjukkan berasal dari kemampuan ekstrak. Pelarut tidak memberikan pengaruh terhadap zona hambat
yang terbentuk, ditunjukkan dengan nilai kontrol negatif yang seluruhnya bernilai nol ketika sudah dikurangi lubang sumuran. Data zona hambat yang didapatkan
selanjutnya dilakukan analisis hasil secara statistik. Analisis hasil secara statistik bertujuan untuk melihat adanya potensi antibakteri ekstrak etanol daun M.
tanarius terhadap bakteri S. pyogenes. Data dianalisis normalitas distribusi menggunakan uji Shapiro Wilk. Royston 1995, mengatakan bahwa jumlah data
antara 3 hingga 5000 dapat dianalisis menggunakan Shapiro Wilk. Dari uji Shapiro Wilk didapatkan hasil data tidak terdistribusi normal Lampiran 10. Data
yang tidak normal, yaitu konsentrasi 20 dan 80 tidak diikut sertakan dalam analisis statistik selanjutnya. Selanjutnya dilakukan uji Levene untuk mengetahui
variasi data Lampiran 11. Pada hasil uji Levene didapatkan variasi data homogen
p0,05 sehingga dapat dilanjutkan uji Anava Satu Arah untuk mengetahui berbeda bermakna. Berdasarkan uji Anava Satu Arah didapatkan nilai p0,05
sehingga terdapat data yang berbeda bermakna secara statistik Lampiran 12. Untuk mengetahui kelompok data yang memiliki perbedaan bermakna
maka dilakukan uji T tidak berpasangan yang didahului uji varian. Uji varian berguna untuk melihat variansi antar 2 kelompok data. Nilai p0,05 menunjukkan
variansi kedua kelompok tidak homogen sedangkan nilai p0,05 menunjukkan variansi kedua kelompok homogen Lampiran 13. Setelah uji varian dilanjutkan
uji T tidak berpasangan antar dua kelompok data dimana nilai p0,05 menunjukkan berbeda bermakna antar dua kelompok data. Berdasarkan hasil uji T
tidak berpasangan didapatkan hampir seluruh kelompok data berbeda bermakna, kecuali antara konsentrasi 5 dengan 10 Lampiran 14.
Berdasarkan hasil analisis statistik tersebut antara kelompok konsentrasi uji dengan kontrol negatif berbeda bermakna. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak
etanol daun M. tanarius memiliki potensi daya antibakteri terhadap S. pyogenes. Selain itu, antar variasi konsentrasi uji juga berbeda bermakna, maka
menunjukkan semakin besar konsentrasi uji memberikan aktivitas antibakteri yang berbeda pula. Namun pada konsentrasi 5 dengan 10 menunjukkan hasil
statistik berbeda tidak bermakna. Hal ini menunjukkan konsentrasi 5 memiliki kemampuan yang sama dengan konsentrasi 10 dalam penghambatan bakteri S.
pyogenes. Pada perbandingan antara kelompok konsentrasi uji dengan kontrol
positif didapatkan hasil statistik berbeda bermakna. Artinya aktivitas antibakteri
yang ditunjukkan ekstrak etanol daun M. tanarius tidak sebesar antibakteri dari Amoxicilin. Hal ini dapat disebabkan karena ekstrak merupakan campuran dari
berbagai senyawa, dimana senyawa yang aktif sebagai antibakteri bercampur dengan senyawa yang tidak aktif sebagai antibakteri. Dapat pula senyawa tersebut
bercampur dengan senyawa yang bersifat antagonis sehingga meniadakan aktivitas antibakteri atau dapat juga bercampur dengan senyawa yang sinergis
namun jumlahnya tidak cukup untuk memberikan aktivitas antibakteri. Perlu penelaahan lebih lanjut untuk mengetahui kandungan senyawa yang memiliki
aktivitas antibakteri dan interaksi kandungan senyawa yang terdapat dalam ekstrak. Selain itu, adanya kemungkinan difusi senyawa terhalangi sehingga tidak
dapat memberikan aksi penghambatan. Sedangkan Amoxicilin yang merupakan turunan penisilin telah lama terbukti memiliki daya antibakteri dengan spektrum
luas. Senyawa yang terkandung didalamnya telah terisolasi menjadi senyawa tunggal serta telah melalui berbagai pengujian sehingga efek penghambatannya
teruji. Menurut David cit., Moerfiah dan Supomo, 2011, ketentuan antibakteri
sebagai berikut : 1.
Sangat kuat diameter zona hambat ≥20 mm 2. Kuat diameter zona hambat 10-20 mm
3. Sedang diameter zona hambat 5-10 mm 4.
Lemah diameter zona hambat ≤ 5 mm Berdasarkan ketentuan tersebut zona hambat yang terbentuk ketika sudah
dikurangi lubang sumuran 6 mm termasuk dalam kekuatan antibakteri sedang
hingga kuat yakni rata-rata 6 hingga 13 mm. Kontrol positif Amoxicilin termasuk dalam kekuatan antibakteri kuat karena memiliki rata-rata 19 mm Lampiran 9.
Gambar 25. Diagram rata-rata diameter zona hambat ekstrak etanol daun M. tanarius terhadap bakteri S. pyogenes
Aktivitas antibakteri yang muncul dikarenakan kandungan senyawa fenolik, flavonoid, tanin dan saponin yang terkandung dalam ekstrak daun M.
tanarius. Turunan fenol berinteraksi dengan sel bakteri melalui proses adsorpsi yang melibatkan ikatan hidrogen. Pada kadar rendah terbentuk kompleks protein
fenol dengan ikatan lemah dan segera mengalami peruraian, diikuti penetrasi fenol ke dalam sel dan menyebabkan prespitasi serta denaturasi protein. Pada kadar
tinggi fenol menyebabkan koagulasi protein dan sel membran mengalami lisis Parwata dan Dewi, 2008. Senyawa fenolik memiliki mekanisme kerja dalam
menghambat pertumbuhan bakteri dengan cara inaktivasi protein enzim pada membran sel. Fenol berikatan dengan protein melalui ikatan hidrogen sehingga
mengakibatkan struktur protein menjadi rusak. Dimana sebagian besar struktur dinding sel dan membran sitoplasma bakteri mengandung protein dan lemak.
Ketidakstabilan pada dinding sel dan membran sitoplasma bakteri menyebabkan 0,00
5,00 10,00
15,00 20,00
25,00
kontrol - 5
10 40
kontrol +
Diameter Zona Hambat
mm ±SD
Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun M. tanarius
Rata-rata Diameter Zona Hambat
Rata-rata Diameter
Zona Hambat
fungsi permeabilitas selektif, fungsi pengangkutan aktif, pengendalian susunan protein dari sel bakteri menjadi terganggu yang akan berakibat pada lolosnya
makromolekul dan ion dari sel, sehingga sel bakteri menjadi kehilangan bentuknya dan terjadilah lisis Susanti, 2008.
Flavonoid bersifat antibakteri karena mampu berinteraksi dengan DNA bakteri. Hasil interaksi ini menyebabkan terjadinya kerusakan permeabilitas
dinding sel bakteri, mikrosom, dan lisosom. Ion hidroksil secara kimia menyebabkan perubahan komponen organik dan transpor nutrisi sehingga
menimbulkan efek toksik terhadap sel bakteri Sabir, 2003. Cincin B pada flavonoid dapat menyebabkan interkalasi atau ikatan hidrogen dengan susunan
asam nukleus basa, hal ini menjelaskan aksi penghambatan pada sintesis DNA dan RNA pada bakteri. Aktivitas antibakteri dari flavonoid juga dilakukan dengan
pengurangan fluiditas membran pada sel bakteri dan penghambatan metabolisme energi pada bakteri Cushnie and Lamb, 2005.
Mekanisme tanin menghambat bakteri belum dijelaskan secara jelas, namun Akiyama, et al., 2001 meringkas mekanisme antimikroba dari tanin
yaitu, i zat astringent pada tanin dapat menginduksi kompleksasi dengan enzim dan substrat, berbagai enzim mikrobial mengalami penghambatan ketika
dicampur dengan tanin, ii toksisitas tanin erat kaitannya dengan aksi pada membran mikroorganisme, dan iii kompleksasi logam ion pada tanin dapat
merusak membran sitoplasma dari bakteri. Aktivitas biologis tanin mungkin ditentukan oleh konfigurasi spasial dari gugus ortho-
phenolic hydroxyl. Tanin telah terbukti mengganggu integritas membran karena menyebabkan kebocoran
dari liposom. Aktivitas tanin lebih rendah pada bakteri Gram negatif oleh adanya lipopolisakarida pada permukaan sel bakteri Gram negatif. Hal ini menyebabkan
bakteri Gram positif lebih sensitif terhadap efek bakterisida tanin dibanding bakteri Gram negatif Smith, Imlay, and Mackie, 2003.
Saponin memiliki sifat seperti deterjen dan mungkin meningkatkan permeabilitas membran sel bakteri tanpa menghancurkan bakteri tersebut. Secara
teori, hal ini mungkin memfasilitasi masuknya zat antibakteri melalui membran dinding sel bakteri Saponin dapat mengganggu permeabilitas pada lapisan terluar
membran. Pada bakteri Gram negatif, lapisan terluar membran dilapisi oleh lipopolisakarida. Saponin hanya berikatan pada bagian Lipid A dan dapat
meningkatkan permeabilitas membran pada bakteri Gram negatif Arabski et al., 2012. Hardiningtyas cit.,
Pranoto, Ma’ruf, dan Pringgenies, 2012
menambahkan, saponin merupakan golongan senyawa yang dapat menghambat atau membunuh mikroba dengan cara berinteraksi dengan membran sterol. Efek
utama saponin terhadap bakteri adalah adanya pelepasan protein dan enzim dari dalam sel.
H. Penentuan KHM dan KBM Ekstrak Etanol Daun M. tanarius
