26
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas.
Konsentrasi ekstrak etanol daun M. tanarius konsentrasi 5, 10, 20, 40, dan 80.
b. Variabel tergantung.
Aktivitas antibakteri ekstrak etanol M. tanarius yang dilihat dari diameter zona hambat dalam milimeter mm.
c. Variabel pengacau terkendali.
Asal daun M. tanarius, waktu inkubasi, suhu inkubasi. d.
Variabel pengacau tak terkendali. Suhu pengeringan simplisia, tetesan embun saat inkubasi.
2. Definisi operasional
a. Ekstrak etanol daun M. tanarius. Ekstrak serbuk daun M. tanarius
yang disari menggunakan etanol 70 dan dihilangkan pelarutnya dengan pemanasan di atas penangas air pada suhu 50-
60˚C hingga kental lalu ditimbang hingga bobot tetap dan
disimpan pada suhu 4˚C. b.
Zona hambat. Daerah jernih di sekitar lubang sumuran yang telah diteteskan ekstrak etanol daun M. tanarius yang menandakan tidak
terdapat pertumbuhan bakteri dinyatakan dalam milimeter mm. c.
Aktivitas antibakteri. Kemampuan ekstrak etanol daun M. tanarius untuk menghambat atau membunuh pertumbuhan bakteri S. pyogenes
yang dibandingkan dengan kontrol negatif. d.
Kontrol negatif. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak etanol daun M. tanarius ketika diteteskan dalam media yaitu aquadest
steril, hasilnya akan digunakan sebagai pembanding. e.
Kontrol positif. Suspensi antibiotik Amoxicilin dengan konsentrasi 25 mgmL
yang telah terbukti mampu menghambat maupun membunuh pertumbuhan bakteri S. pyogenes yang hasilnya digunakan
sebagai pembanding ekstrak etanol daun M. tanarius.
C. Bahan Penelitian
Daun M. tanarius yang diperoleh dari kebun obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang dipanen pada bulan Juli 2013. Media Nutrient
Agar NA Oxoid, Nutrient Broth NB Oxoid, Blood Agar Plate BAP
Larutan Mac Farland 0,5, kultur murni S. pyogenes ATCC 19615 yang diperoleh dari Balai Kesehatan, Yogyakarta EQAM Belgia. Etanol 70 teknis, aquadest
steril, suspensi antibiotik Amoxicilin Indofarma. Kalium hidroksida LP, natrium hidroksida, asam klorida, natrium klorida 2, gelatin 1, Bourchadat LP, dan
Mayer LP. Silika gel 60F
254
, asam asetat, air, etil asetat, asam formiat, toluene, rutin, asam gallat, besi III klorida, dan sitroborat.
D. Alat Penelitian
Alat-alat gelas Pyrex, pipet ukur Pyrex, aluminium foil, mikropipet, neraca analitik Mettler Toledo, cawan petri Pyrex, cawan porselen, grinder,
kulkas, oven Memmert, Microbiological Safety Cabinet MSC, inkubator, autoklaf, jarum ose, batang pengaduk, stirer, hot plate, sendok, bunsen, pelubang
sumuran, mikropipet, pipet tetes, tabung reaksi, gelas arloji, labu ukur. Penangas air Memmert, drying box, mesin penyerbuk, ayakan nomor 40, corong, corong
Buchner, rotarry vaccum evaporator Buchi, UV cabinet, chamber.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman Macaranga tanarius
Dilakukan pengamatan terhadap pohon dan bagian tanaman seperti daun, batang, buah dan bunga. Bagian tanaman tersebut dicocokkan dengan
ciri morfologi tanaman Macaranga tanarius yang terdapat pada buku Flora of Java Jilid I mengikuti panduan determinasi tanaman.
2. Pembuatan serbuk daun M. tanarius
Daun M. tanarius sebanyak 500 g dicuci dengan air mengalir, dikeringkan dibawah sinar matahari ditutup dengan kain hitam selama satu
hari. Pengeringan dilanjutkan dalam oven pada suhu 40- 50˚C selama satu hari
hingga dapat hancur ketika diremas, dibuat serbuk dengan grinder dan diayak pada ayakan nomor mesh 40.
3. Pembuatan ekstrak etanol daun M. tanarius
Serbuk daun M. tanarius sebanyak 30 g diekstraksi secara maserasi menggunakan 300 mL etanol 70 selama lima hari ditempat gelap dan
terlindung dari cahaya. Selama roses maserasi dilakukan penggojogan setiap 24 jam sekali untuk meratakan penyarian. Setelah maserasi selama lima hari
kemudian filtrat dipisahkan dan dilakukan remaserasi selama dua hari dengan penambahan penyari yang baru dengan perbandingan yang sama Badan POM
RI, 2010. Filtrat disimpan dalam kulkas bersuhu 4°C dan dicampur dengan filtrat hasil remaserasi. Hasil ekstraksi dipisahkan antara filtrat dengan serbuk
menggunakan kertas saring dengan bantuan corong Buchner yang terhubung dengan vaccum. Filtrat hasil maserasi dan remaserasi yang telah dicampur
kemudian dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator hingga tidak ada penyari yang menetes pada alat. Filtrat yang pekat tersebut dikumpulkan pada
cawan porselen dan diuapkan diatas waterbath untuk mendapatkan ekstrak kental. Ekstrak kental ditimbang hingga bobot tetap untuk memastikan pelarut
benar-benar hilang. Ekstrak disimpan dalam kulkas bersuhu 4˚C hingga
digunakan.
4. Pembuatan variasi konsentrasi ekstrak daun M. tanarius
Variasi konsentrasi ekstrak daun M. tanarius dibuat dengan melarutkan ekstrak dengan aquadest steril hingga konsentrasi yang ingin
diperoleh. Ekstrak dibuat dalam konsentrasi 5, 10, 20, 40, dan 80 50 mgmL, 100 mgmL, 200 mgmL, 400 mgmL, dan 800 mgmL.
5. Uji skrining fitokimia daun M. tanarius
Skrinning fitokimia daun M. tanarius dilakukan terhadap senyawa fenolik, flavonoid, tanin, alkaloid, dan saponin.
a. Uji pendahuluan. Uji pendahuluan dilakukan dengan uji tabung. Sebanyak 2
gram serbuk daun M. tanarius ditambahkan 10 mL aquadest, kemudian dipanaskan selama 30 menit diatas penangas air dan disaring. Filtrat
diamati, bila muncul larutan kuning kemerahan menunjukkan adanya senyawa yang mengandung kromofor flavonoida dan antrakinon.
Kemudian dengan penambahan larutan kalium hidroksida LP 3 tetes maka warna larutan akan menjadi lebih intensif Herlianawati, 2007.
b. Uji senyawa fenolik. Uji kandungan senyawa fenolik dilakukan dengan uji
tabung dan ditegaskan dengan uji KLT. Pada uji tabung, sebanyak 2 gram serbuk daun M. tanarius ditambahkan 10 mL aquadest, kemudian
dipanaskan selama 10 menit diatas penangas air. Disaring panas-panas lalu didinginkan, kemudian filtrat ditambahkan 3 tetes pereaksi besi III klorida.
Terjadinya warna hijau-biru menunjukkan adanya senyawa fenolik Harborne, 1987. Pada uji KLT, chamber tempat pemisahan dijenuhkan
dengan menggunakan fase gerak yang akan digunakan. Uji kandungan
senyawa fenolik dilakukan dengan menggunakan plat KLT silika gel 60F
254
dan fase gerak etil asetat : asam formiat : toluene : air 6 : 1,5 : 2 : 1. Pembanding yang digunakan adalah asam gallat yang dibuat dengan
melarutkan 10 mg asam galat dalam 1 mL etanol. Plat KLT ditotol dengan ekstrak etanol daun M. tanarius dalam konsentrasi 10, dibuat dengan
menimbang ekstrak etanol daun M. tanarius sebanyak 1 gram dan dilarutkan dalam etanol 70 hingga 10 mL. Senyawa dielusi hingga mencapai batas
8 cm dalam fase gerak. Setelah proses elusi selesai, plat diangin-anginkan agar fase gerak menguap dan diamati dibawah UV 254 nm dan 365 nm
Wagner, Bladt, and Zgainski, 1984. Untuk senyawa fenolik dilakukan deteksi dengan besi III klorida dan hasil positif berupa bercak berwarna
hitam Marliana, 2007. c.
Uji flavonoid. Uji kandungan flavonoid dilakukan dengan uji tabung dan ditegaskan dengan uji KLT. Pada uji tabung, sebanyak 0,2 g serbuk
dilarutkan ke dalam natrium hidroksida akan terjadi pembentukan intensitas warna kuning. Pada penambahan asam klorida terjadi perubahan intensitas
warna kuning menunjukkan adanya flavonoid Wibowo, 2013. Uji KLT flavonoid digunakan fase diam silika gel 60F
254
dan fase gerak etil asetat - asam formiat - asam asetat - air 100 : 11 : 11 : 27. Pembanding yang
digunakan adalah rutin yang dibuat dengan melarutkan 10 mg rutin dalam 1 mL etanol. Plat KLT ditotol dengan ekstrak etanol daun M. tanarius
dalam konsentrasi 10, dibuat dengan menimbang ekstrak etanol daun M. tanarius sebanyak 1 gram dan dilarutkan dalam etanol 70 hingga 10 mL.
Senyawa dielusi hingga mencapai batas 8 cm dalam fase gerak. Setelah proses elusi selesai, plat diangin-anginkan agar fase gerak menguap dan
diamati dibawah UV 254 nm dan 365 nm Wagner, Bladt, and Zgainski, 1984. Hasil positif flavonoid ditunjukkan dengan bercak warna kuning atau
kuning coklat setelah disemprot sitroborat Schneider cit., Meiyanto, dkk., 2011.
d. Uji tanin. Uji kandungan tanin dilakukan dengan uji tabung. Sebanyak 2
gram serbuk daun M. tanarius ditambahkan 10 ml aquadest, kemudian dipanaskan selama 30 menit diatas penangas air dan disaring. Sebanyak
5 mL filtrat ditambahkan natrium klorida 2 sebanyak 1 mL. Bila terjadi endapan atau suspense, disaring menggunakan kertas saring. larutan gelatin
1 ditambahkan sebanyak 5 mL, bila terbentuk endapan menunjukkan adanya tanin Marliana, 2005.
e. Uji alkaloid. Uji kandungan alkaloid dilakukan dengan uji tabung. Sebanyak
500 mg serbuk daun M. tanarius ditambahkan 1 mL asam klorida 2N dan 9 mL. Dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan
disaring. Sebanyak 3 tetes filtrat dipindahkan ke kaca arloji dan ditambahkan 2 tetes Bourchadat LP. Bila terdapat endapan maka
menunjukkan alkaloid golongan II. Sebanyak 3 tetes filtrat dipindahkan ke kaca arloji dan ditambahkan 2 tetes Mayer LP. Bila filtrat membentuk
endapan, maka menunjukkan adanya kandungan alkaloid golongan III Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995.
f. Uji saponin. Uji kandungan saponin dilakukan dengan uji tabung dan uji
hemolisis. Pada uji tabung, serbuk daun M. tanarius dimasukkan sebanyak 0,5 g dalam tabung reaksi. Ditambahkan 10 mL air panas, didinginkan dan
kemudian dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Terbentuknya buih selama ± 10 menit setinggi 1 cm sampai 10 cm dan dengan penambahan 1 tetes
asam klorida 2N buih tidak hilang menunjukkan positif adanya saponin Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995. Untuk memastikan
kandungan saponin dalam daun M. tanarius dilakukan uji hemolisis. Sebanyak 40 µL ekstrak etanol daun M. tanarius yang dilarutkan dalam
aquadest diteteskan dalam lubang sumuran pada media BAP. Didiamkan selama satu hari kemudian diamati hasilnya. Bila area sekitar lubang
sumuran berubah warna menjadi kuning artinya terjadi proses hemolisis dan menunjukkan adanya kandungan saponin dalam ekstrak daun M. tanarius.
6. Uji antibakteri
a. Pembuatan suspensi bakteri S. pyogenes. Kultur murni bakteri S. pyogenes
yang didapatkan dari Balai Kesehatan Yogyakarta diambil sebanyak satu ose, di kultur pada media NB dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah
inkubasi, dibuat suspensi bakteri uji yang kekeruhannya disetarakan dengan larutan Mac Farland 0,5 untuk mendapatkan kepadatan populasi bakteri 1,5
x 10
8
CFU. b.
Pembuatan suspensi antibiotik sebagai kontrol positif. Antibiotik Amoxicilin dry syrup dilarutkan dalam aquadest steril hingga mendapatkan
konsentrasi 25 mgmL. Di-vortex hingga homogen terutama saat sebelum digunakan.
c. Pembuatan sumuran pada media NA. Media NA dituangkan dalam petri
kemudian didiamkan hingga memadat sebagai base layer. Media NA yang masih dalam bentuk cair diinokulasi dengan suspensi bakteri uji secara pour
plate, dituang dalam cawan petri yang telah terdapat base layer dan didiamkan hingga memadat sebagai seed layer. Dengan menggunakan
pelubang sumuran, media yang telah memadat tersebut dibuat lubang- lubang sumuran pada seed layer namun tidak menembus base layer. Jumlah
lubang yang dibuat sesuai dengan seri konsentrasi ekstrak etanol daun M. tanarius, kontrol negatif dan kontrol positif.
d. Uji daya antibakteri secara difusi sumuran. Pada lubang-lubang sumuran,
diberikan ekstrak yang telah dilarutkan dalam aquadest steril dengan variasi konsentrasi 5, 10, 20, 40, dan 80 50 mgmL, 100 mgmL, 200
mgmL, 400 mgmL, dan 800 mgmL sebanyak 40 µL. Kontrol positif yaitu suspensi antibiotik Amoxicilin dan kontrol negatif yaitu aquadest steril
sebagai pelarut ekstrak diberikan dalam lubang sumuran. Dilakukan inkubasi pada suhu 37˚C selama 24 jam, setelah waktu inkubasi diamati
hasilnya. e.
Penentuan KHM dan KBM dengan matode dilusi padat. Pada pengamatan hasil, dilihat zona hambat yang terbentuk disekitar sumuran. Setelah
mendapatkan zona hambat, range konsentrasi zona hambat digunakan untuk menentukan KHM dan KBM dengan metode dilusi padat. Variasi
konsentrasi dilusi padat dibuat berdasarkan konsentrasi terkecil yang masih memberikan zona hambat dari uji potensi antibakeri. Suspensi bakteri uji
dan ekstrak yang telah dilarutkan sesuai variasi konsentrasi diinokulasikan secara pour plate dalam media NA dengan perbandingan suspensi bakteri :
ekstrak 1 : 1. Diinkubasi dalam suhu 37˚C selama 24 jam. Hasil inkubasi
dilakukan penegasan hasil dengan melakukan streak pada media NA dan diinkubasi pada
suhu 37˚C selama 24 jam. Pada hasil streak diamati berdasarkan kekeruhan pertumbuhan bakteri pada media. Media yang jernih
tidak adanya pertumbuhan bakteri diberi notasi -, media yang keruh diberi notasi ++, dan sangat keruh +++. Konsentrasi terkecil yang menunjukkan
tidak adanya pertumbuhan bakteri selanjutnya dilakukan uji penegasan. f.
Uji penegasan. Media yang jernih dipilih dua konsentrasi terkecil untuk selanjutnya dilakukan uji penegasan. Permukaan media digores dengan ose,
kemudian digoreskan pada media yang masih steril. Adanya pertumbuhan bakteri pada bekas goresan menunjukkan pada konsentrasi tersebut terjadi
kemampuan penghambatan pertumbuhan bakteri sedangkan tidak adanya pertumbuhan bakteri menunjukkan pada konsentrasi tersebut terjadi
kemampuan membunuh pertumbuhan bekteri. Konsentrasi terkecil yang menunjukkan tidak adanya pertumbuhan bakteri ditentukan sebagai KBM,
sedangkan konsentrasi terkecil yang menunjukkan masih adanya pertumbuhan bakteri ditentukan sebagai KBM.
F. Analisis Hasil
Data dari hasil penelitian ini berupa data diameter zona hambat, data nilai KHM dan KBM, dan data hasil uji KLT. Data diameter zona hambat dianalisis
secara statistik menggunakan uji Shapiro-Wilk untuk mengetahui data memiliki distribusi normal atau tidak. Data dinyatakan terdistribusi normal bila nilai
p0,05. Dilakukan uji Levene untuk mengetaui variasi data. Bila data terdistribusi normal dan variasi
data homogen dilanjutkan uji Anava Satu Arah untuk mengetahui paling tidak terdapat dua kelompok data yang memiliki perbedaan
bermakna dengan nilai p0,05. Untuk mengetahui kelompok mana yang memiliki perbedaan maka dilakukan uji T tidak berpasangan untuk mengetahui pada variasi
konsentrasi ekstrak etanol daun M. tanarius berapa terdapat perbedaan bermakna dengan kontrol negatif dan kontrol positif maupun antar variasi konsentrasi.
Data KHM dan KBM dianalisis dengan analisis deskriptif berdasarkan kekeruhan pertumbuhan bakteri yang dibandingkan dengan kontrol negatif dan
kontrol positif. Selanjutnya dilakukan uji penegasan KHM dan KBM dengan streak plate untuk menentukan nilai KHM dan KBM. Data hasil uji kualitatif
kandungan kimia daun M. tanarius dilakukan dengan mengamati bercak yang tampak pada KLT secara visual dibawah lampu UV 254 nm dan 365 nm.
Bercak pada kromatogram dihitung Retardation factor Rf dengan rumus:
� =
� �
� �
� �
Ganjar dan Rohman, 2007. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Warna bercak dan harga Rf sampel dibandingkan dengan standar pembanding. Bila warna bercak dan harga Rf mendekati pembanding,
menunjukkan komponen senyawa kimia sampel sama dengan standar pembanding.
38
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Identifikasi Bahan Tanaman Macaranga tanarius L. M. A.
Penelitian ini menggunakan daun Macaranga tanarius L. M. A. yang berasal dari kebun obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Identifikasi
bahan tanaman bertujuan untuk memastikan kebenaran bahan yang akan digunakan dalam penelitian ini. Identifikasi dilakukan dengan mencocokkan ciri
morfologi tanaman seperti daun, batang, bunga dan buah menurut pustaka acuan yaitu Backer, C. A. and Bakhuizen van den Brink, 1983.
A B
Gambar 4. Tanaman A dan daun segar B M. tanarius
Berdasarkan hasil determinasi tanaman didapatkan hasil bahwa benar tanaman
yang digunakan merupakan tanaman Macaranga tanarius L. M. A. Lampiran 1.
Kategori