BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental karena ada subjek uji yang dikenakan perlakuan.
B. Variabel - Variabel Penelitian 1.
Variabel bebas
Variabel bebas adalah variabel yang direncanakan untuk diteliti pengaruhnya terhadap variabel tergantung. Variabel bebas dalam penelitian ini
adalah konsentrasi fraksi etil asetat buah ketapang.
2. Variabel tergantung
Variabel tergantung adalah pusat persoalan yang merupakan kriteria dari penelitian ini. Variabel tergantung dari penilitian ini adalah aktivitas antioksidan
buah ketapang, dilihat dari persen scavenging.
3. Variabel pengacau
Variabel pengacau adalah variabel yang secara teoritis diketahui memiliki pengaruh terhadap hasil dan tidak dikehendaki. Variabel pengacau terkendali
dalam penelitian ini adalah tempat tumbuh tanaman, waktu pemanenan, umur buah yang dipanen, cara panen, cara pengeringan dan pembuatan simplisia,
jumlah g simplisia yang digunakan, suhu dan waktu inkubasi larutan uji. Variabel pengacau tak terkendali adalah cahaya matahari, cuacamusim, curah
hujan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
C. Definisi Operasional 1.
Uji aktivitas antioksidan
Uji aktivitas antioksidan adalah uji untuk menentukan ada tidaknya senyawa antioksidan dalam buah ketapang dan seberapa besar kemampuan buah
ketapang dalam menangkap radikal hidroksil, sehingga didapatkan nilai penangkapan efektif effective scavenging radikal hidroksil sebesar 50 ES
50
yang menggambarkan kekuatan antioksidan buah ketapang.
2. Fraksi etil asetat
Fraksi etil asetat adalah hasil dari fraksinasi ekstrak etanol buah ketapang dengan menggunakan etil asetat.
3. Kandungan senyawa flavonoid total
Kandungan senyawa flavonoid total adalah jumlah keseluruhan senyawa polifenol yang mempunyai kerangka karbon dengan dua gugus C
6
disambungkan oleh rantai alifatik 3 karbon yang diperoleh dari perbandingan antara besarnya
resapan yang terbaca pada spektrofotometer visibel dengan berat cuplikan, dinyatakan sebagai gram ekivalen kuersetin dalam setiap 100 gram berat kering
ekstrak g Ekivalen Kuersetin100 g.
4. Buah ketapang
Buah ketapang adalah buah dari tanaman ketapang yang berbentuk oval seperti almond, berwarna hijau, panjangnya 3,5-7 cm dan lebar 2-5,5 cm, yang
memiliki eksokarpium berupa kulit buah yang berwarna hijau, mesokarpium berupa serat-serat yang tersusun menjadi serabut yang tebal, berwarna kuning
gading, endokarpium berupa lapisan keras seperti batok kelapa yang melindungi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
biji yang terdapat di dalamnya, berwarna coklat, dan yang paling dalam adalah biji yang berwarna putih
D. Bahan Penelitian
Bahan uji yang digunakan adalah: buah ketapang yang diambil dari Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Bahan-bahan kualitas
p.a.E.Merck: dinatrium hidrogen fosfat, kalium dihidrogen fosfat, asam thiobarbiturat, asam trikloro asetat, ferri klorida heksahidrat,
etilendiamintetraasetat garam dinatrium dihidrat, hidrogen peroksida Larutan 30 H
2
O
2
, L + asam askorbat vitamin C, etil asetat, natrium nitrit, aluminium klorida, natrium hidroksida, selulosa. Bahan-bahan kualitas p.a.Sigma: 2-deoksi-
D-ribosa, kuersetin. Bahan-bahan farmasetis : etanol 96 CV. General Labora dan aquades.
E. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah: spektrofotometer UV- Vis Perkin Elmer Lamda 20, pH meter Metrohm, Vacuum rotary evaporator
Buchi rotavapor, waterbath Labo-tech, Heraeus, hot plate, neraca analitik scaltec SBC 22, BP 160P, oven, vorteks Janke Kunkel, mikropipet 10-100
μL dan 100-1000μL Acura 825, mikropipet 0,5-5,0 mL Socorex, tabung reaksi bertutup Schott-Germany, alat ultrasonic Retsch tipe T 460 No.V935922013
EY alat-alat untuk KLT dan alat-alat gelas Pyrex-Germany dan Iwaki.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
F. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman ketapang dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi USD menurut buku Flora of Java Backer and
Bakhuizen van den Brink, 1965.
2. Pengumpulan bahan
Buah ketapang diperoleh dari fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta pada bulan Mei 2007. Buah yang digunakan adalah buah yang masih
muda. Dikumpulkan pagi hari, pukul enam pagi.
3. Pembuatan ekstrak etanol buah ketapang
Ekstrak etanol disari dengan menggunakan cara perkolasi. Sebanyak 150 g serbuk buah ketapang yang telah dihaluskan dan diayak dengan menggunakan
ayakan dengan derajat halus 824, direndam dalam cairan penyari yaitu etanol 70 campuran etanol air 7:3 dan didiamkan selama 24 jam dalam bejana
tertutup. Massa serbuk dan cairan penyari kemudian dimasukkan ke dalam perkolator. Cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan tetesan 1 mL tiap menit.
Perkolat yang didapat ditampung, kemudian ampas diberi cairan penyari kembali sampai perkolat yang keluar sudah jernih. Perkolat yang didapat dipekatkan
dengan vaccum rotaevaporator rotavapor. Proses dilakukan sampai seluruh etanol diperkirakan telah menguap. Ekstrak yang didapat, dikumpulkan dan
diuapkan di atas waterbath dengan suhu maksimum 50
o
C hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental yang didapat, ditimbang untuk didapatkan
rendemen dan disimpan dalam eksikator.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4. Pembuatan fraksi etil asetat buah ketapang
Ekstrak kental yang didapat dilarutkan dalam 100 mL air panas. Larutan ekstrak didinginkan kemudian dimasukkan dalam corong pisah. Ditambahkan etil
asetat sebanyak 100 mL, kemudian digojog selama 15 menit dan didiamkan 5 menit. Ekstraksi dilakukan selama 9 kali berdasarkan optimasi. Didapatkan
fraksi air dan fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat dipekatkan dengan rotavapor. Proses dilakukan sampai seluruh etil asetat diperkirakan telah menguap. Fraksi
yang didapat, dikumpulkan dan diuapkan di atas waterbath dengan suhu maksimum 50
o
C hingga diperoleh fraksi kental. Fraksi kental yang didapat, ditimbang untuk mendapatkan rendemen dan disimpan dalam eksikator.
5. Uji kualitatif kandungan flavonoid dengan metode KLT
Disiapkan larutan fraksi etil asetat buah ketapang. Sebanyak 10 µL larutan tersebut ditotolkan pada lempeng selulosa dengan rutin konsentrasi 0,05
sebagai pembanding. Lempeng KLT tersebut dielusi dengan fase gerak N- butanol-Asam Asetat-Air BAA dengan perbandingan 4:1:5. Setelah dielusi
bercak diamati pada cahaya tampak, UV 365 nm, dan UV 254 nm. Deteksi dengan uap amonia dan pereaksi semprot FeCl
3
dilakukan untuk memperjelas bercak. Bercak juga diamati pada cahaya tampak, UV 365nm, dan UV 254 nm.
6. Pembuatan buffer fosfat
Buffer fosfat dibuat dengan bantuan pH meter a.
Pembuatan dinatrium hidrogen fosfat 20 mM Timbang saksama 1,42 g Na
2
HPO
4
dan larutkan dalam akuades hingga 500,0mL.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
b. Pembuatan kalium dihidrogen fosfat 20mM
Timbang saksama 0,68g KH
2
PO
4
dan larutkan dalam akuades hingga 250,0mL. Larutan KH
2
PO
4
ditambahkan secara bertetes-tetes pada larutan Na
2
HPO
4
hingga tercapai pH 7,4.
7. Pembuatan pereaksi
a. Larutan FeCl
3
1 mM Sebanyak lebih kurang 13,52 mg FeCl
3
.6H
2
O ditimbang saksama dan dilarutkan dengan akuades dalam labu ukur 10,0 mL. Dari larutan tersebut
diambil sebanyak 2,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan harus selalu
dibuat baru. b.
Larutan EDTA 1 mM Sebanyak lebih kurang 18,61 mg Na
2
EDTA.2H
2
O ditimbang saksama dan dilarutkan dengan akuades dalam labu ukur 10,0 mL. Dari larutan tersebut
diambil sebanyak 2,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda.
c. Larutan vitamin C 1mM
Sebanyak lebih kurang 17,61 mg vitamin C ditimbang saksama dan dilarutkan dengan akuades dalam labu ukur 10,0 mL. Dari larutan tersebut
diambil sebanyak 1,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda. Larutan harus selalu
dibuat baru.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
d. Larutan H
2
O
2
20 mM Sebanyak 0,045 mL larutan H
2
O
2
30 dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0mL dan ditambahkan akuades hingga tanda. Dari larutan tersebut
diambil sebanyak 5,0 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL kemudian diencerkan dengan akuades hingga tanda.
e. Larutan TCA 5
Sebanyak 1,25 g TCA ditimbang saksama dan dilarutkan dalam akuades hingga 25,0 mL dalam labu ukur.
f. Larutan TBA 1
Sebanyak 0,25 g TBA ditimbang saksama, dimasukkan ke dalam beaker glass
100 mL, ditambahkan akuades secukupnya kemudian dipanaskan di atas hot plate pada suhu 50-55
o
C hingga larut. Larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 25,0 mL dan ditambah akuades hingga tanda.
g. Pembuatan larutan kuersetin 8,16 mgmL
Sebanyak 816,0 mg serbuk kuersetin dimasukkan dalam labu takar 100,0mL dan ditambahkan metanol hingga batas tanda.
h. Pembuatan larutan natrium nitrit 10.
Sebanyak 10,0g natrium nitrit dilarutkan dengan aquades secukupnya dalam beaker glass
, larutan kemudian dipindahkan dalam labu takar 100,0mL dan ditambahkan aquades hingga batas tanda.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i. Pembuatan larutan aluminium klorida 10
Sebanyak 5,0 g aluminium klorida dilarutkan dengan aquades secukupnya dalam beaker glass, larutan kemudian dipindahkan dalam labu takar 50,0mL
dan ditambahkan aquades hingga batas tanda. j.
Pembuatan larutan natrium hidroksida 10 Sebanyak 10,0 g natrium hidroksida dilarutkan dengan aquades secukupnya
dalam beaker glass, larutan kemudian dipindahkan dalam labu takar 100,0mL dan ditambahkan aquades hingga batas tanda.
8. Optimasi Metode
a. Penentuan waktu operasi
Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600 μL larutan
Deoksiribosa 2,5mM, 300 μL FeCl
3
1mM, 300 μL EDTA 1mM, 300 μL
H
2
O
2
20mM, 4500 μL buffer fosfat pH 7,4, dan 300 μL vitamin C 1mM.
Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit. Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 dan 1 mL TCA 5 , vorteks
campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada suhu 80
o
C selama 30 menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air
mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum teoritis 532 nm selama 30 menit.
b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600 μL larutan
Deoksiribosa 2,5mM, 300 μL FeCl
3
1mM, 300 μL EDTA 1mM, 300 μL
H
2
O
2
20mM, 4500 μL buffer fosfat pH 7,4, dan 300 μL vitamin C 1mM.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit. Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 dan 1 mL TCA 5 , vorteks
campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada suhu 80
o
C selama 30 menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air
mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca absorbansinya dari panjang gelombang 400-600 nm.
9. Uji aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat buah ketapang
a. Pembuatan larutan kontrol
Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan 300 μL FeCl
3
1mM, 300 μL EDTA
1mM, 300 μL H
2
O
2
20mM, 4500 μL buffer fosfat pH 7,4, dan 300 μL
vitamin C 1mM. Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu 37
o
C selama 30 menit. Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 dan 1 mL TCA 5,
vorteks campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada suhu 80
o
C selama 30 menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah
air mengalir selama 5 menit. b.
Penentuan aktivitas penangkapan radikal hidroksil Pada tabung reaksi bertutup dimasukkan sebanyak 600
μL larutan Deoksiribosa 2,5mM dan fraksi etil asetat buah ketapang sebanyak 200, 400,
600, 800, dan 1000 μL, kemudian pada masing-masing tabung ditambahkan
300 μL FeCl
3
1mM, 300 μL EDTA 1mM, 300 μL H
2
O
2
20mM, buffer fosfat pH 7,4 penambahan buffer fosfat disesuaikan dengan volume fraksi
etil asetat yang ditambahkan sehingga volume akhir larutan 6 mL, dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
300 μL vitamin C 1mM. Vorteks campuran, kemudian inkubasi pada suhu
37
o
C selama 30 menit. Setelah itu tambahkan 1 mL TBA 1 dan 1 mL TCA 5, vorteks campuran, kemudian panaskan dengan waterbath pada
suhu 80
o
C selama 30 menit. Tabung reaksi yang berisi campuran didinginkan di bawah air mengalir selama 5 menit. Larutan dibaca
absorbansinya pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi.
10. Penentuan kadar flavonoid total
a. Pembuatan kurva baku kuersetin
Dibuat larutan induk kuersetin dengan konsentrasi 8,16 mgmL dalam aquades. Sebanyak 100; 200; 300; 400; 500; 600; 750; dan 900
μL larutan induk dimasukkan ke dalam labu takar 10,0 mL, ditambahkan 4,0 mL
aquades dan 0,30 mL larutan NaNO
2
10, lalu dibiarkan selama 6 menit. Kemudian ditambahkan dengan 4,0 mL NaOH 10 dan aquades sampai
volume 10,0 mL. Larutan dibiarkan selama 15 menit dan absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 510 nm.
b. Penentuan kadar flavonoid total dalam fraksi etil asetat
Ditimbang lebih kurang fraksi etil asetat sebanyak 25 mg kemudian ditambahkan metanol dalam labu ukur sampai 100 mL, sehingga konsentrasi
awal 0,025 g100 mL. Diambil 250 µL larutan fraksi, ditambahkan metanol dalam labu ukur 10 mL sampai tanda, sehingga konsentrasinya menjadi
0,00625 g100 mL = 6,25 mg100 mL = 6,25 mg. Larutan kedua yang digunakan dalam penentuan kadar flavonoid total, yang selanjutnya
dinamakan sampel.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Diambil 250 μL sampel dan dimasukkan kedalam labu takar 10,0 mL dan
dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku. Kadar flavonoid total dinyatakan sebagai gram ekuivalen kuersetin dalam setiap
100g berat kering ekstrak g Ekivalen Kuersetin100g.
G. Analisis Hasil
1. Data kromatografi berupa hRf dan warna bercak sebelum dan sesudah
ditambah pereaksi, diamati dengan sinar tampak maupun dengan sinar UV 254 nm dan 365 nm, lalu dianalisis berdasarkan kriteria yang terdapat
dalam pustaka untuk memperkirakan kandungan flavonoid. 2.
Hasil absorbansi senyawa uji dengan absorbansi kontrol diolah menggunakan analisis regresi linear antara konsentrasi senyawa uji x
dengan aktivitas antioksidan y untuk mendapatkan ES
50
. 3.
Kadar senyawa flavonoid total dianalisis menggunakan persamaan regresi linear dengan data kurva baku secara intrapolasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman merupakan langkah awal yang dilakukan dalam suatu penelitian yang menggunakan sampel berupa tumbuhan. Determinasi
bertujuan untuk mengetahui dan memastikan kebenaran identitas tanaman yang akan digunakan dalam penelitian untuk menghindari terjadinya kesalahan dalam
pengambilan sampel analis fitokimia. Determinasi tanaman ketapang dilakukan di laboratorium biologi farmasi menurut buku Flora of Java Backer and Bakhuizen
van den Brink, 1965. Hasil determinasi tanaman ketapang sebagai berikut:
1b-2b-3b-4b-12b-13b-14b-17b-18b-19b-20b-21b-22b-23b-24b-25b-26b-27b- 799b-800b-801b-802b-806b-807b-809b-810b-811b-825b-826b-829b-830b-
831b-832b-833b-834b-983b-984b-986b-991b-992b-993b-994b-995b-1014a- 1017a-1018b-1026b-1027b-1028b…..87. Combretaceae
1b….. Terminalia 1b-3b….. T. catappa L.
B. Hasil Pengumpulan Bahan
Buah ketapang yang akan digunakan diperoleh dari Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Buah dipetik pada pagi hari pukul enam
pagi ketika proses fotosíntesis belum terjadi. Pada saat dipetik, dipilih buah yang tua tetapi belum matang dan masih berwarna hijau tidak berwarna kuning atau
51
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kategori