Hasil Pembuatan Fraksi Etil Asetat Buah Ketapang Hasil Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil dengan Metode Deoksiribosa

dengan rendemen sebesar 18,05. Ekstrak disimpan dalam eksikator untuk melindungi dari uap air udara.

D. Hasil Pembuatan Fraksi Etil Asetat Buah Ketapang

Pembuatan fraksi etil asetat menggunakan proses ekstraksi dengan menggunakan dua pelarut yang tidak saling campur. Ekstrak kental etanol yang didapat dilarutkan terlebih dahulu dengan 100 mL air hangat, dan kemudian disebut sebagai fraksi air. Tujuan dari proses separasi adalah menghilangkan memisahkan senyawa yang tidak dikehendaki semaksimal mungkin tanpa berpengaruh pada senyawa kandungan yang dikehendaki, sehingga diperoleh ekstrak yang lebih murni Anonim, 2000. Proses separasi dilakukan dengan menggojok fraksi air dalam corong pisah menggunakan pelarut etil asetat. Etil asetat merupakan pelarut yang paling baik untuk aglikon flavonoid dan dianjurkan untuk digunakan dalam proses pemurnian Robinson, 1995. Pada saat pemisahan fraksi etil asetat berada di atas sedangkan fraksi air berada di bawah. Hal ini disebabkan karena berat jenis air 0,997 lebih besar dari etil asetat 0,898. Fraksi air diekstraksi dengan etil asetat sebanyak 100 mL, ekstraksi diulang 9 kali. Etil asetat yang ditambahkan sebanding dengan air yang ditambahkan ketika pertama akan mempartisi, sebanyak 100 mL. Ekstraksi dilakukan berulang dengan jumlah pelarut yang sedikit dimaksudkan untuk mengefektifkan separasi artinya senyawa yang diinginkan akan didapat dalam jumlah yang lebih banyak. Sembilan kali ekstraksi merupakan hasil optimasi. Pada saat menggojog, kekuatan yang diberikan tidak terlalu keras hanya penggojogan lemah saja untuk menghindari terjadinya emulsi, karena proses PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI pemisahan akan berlangsung lebih lama ketika terbentuk emulsi. Selanjutnya, fraksi air dibuang dan fraksi etil asetat dikentalkan diuapkan di atas penangas air sampai didapat ekstrak kental etil asetat, yang selanjutnya disebut fraksi etil asetat. Berat fraksi etil asetat 4,28 g, dengan rendemen 2,85.

E. Hasil Uji Kualitaif Flavonoid dengan metode KLT

Gambar 9 . Struktur rutin Pada penelitian ini dilakukan uji kualitatif terhadap fraksi etil asetat untuk mengetahui apakah di dalam buah ketapang mengandung flavonoid. Sebagai pembanding digunakan rutin yang merupakan senyawa golongan flavonoid. Rutin merupakan glikosida flavonol yang pada umumnya terdapat dalam tanaman, dan terdiri atas kuersetin aglikon dan disakarida rutinosa. Metode yang digunakan adalah metode KLT, dengan selulosa sebagai fase diam dan n-butanol-asam asetat-air BAA 4:1:5 vv sebagai fase gerak. Fase diam tidak menggunakan silika gel GF 254 karena dapat membentuk ikatan dengan flavonoid. Hal ini menyebabkan flavonoid tidak dapat terelusi dengan baik. Ikatan yang terjadi adalah ikatan dengan Ca kalsium yang terdapat pada gipsum perekat pada silika gel GF 254. Fase geraknya BAA karena disarankan untuk pemeriksaan awal keberadaan flavonoid. Penjenuhan menggunakan kertas saring. Tujuan dari PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI penjenuhan chamber adalah untuk mempercepat elusi sehingga waktu yang digunakan lebih singkat. 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 hRf 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 hRf 1 2 1 2 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 hRf A B C Gambar 10 Foto kromatogram uji kualitatif flavonoid pada fraksi etil asetat dengan fase diam: selulosa, fase gerak: n-butanol-asam asetat-air 4:1:5vv, deteksi: uap amonia, pengembangan: 10cm. Keterangan:A: cahaya tampak, B: UV 365, C: UV 254

1: rutin, 2: fraksi etil asetat

Deteksi bercak menggunakan uap amonia. Warna kedua bercak tidak nampak ketika dilihat pada cahaya tampak baik sebelum maupun setelah diuapi amonia. Warna kedua bercak nampak ketika dilihat pada UV 365 dan UV 254 setelah diuapi amonia. Kedua bercak memberikan warna kuning tua ketika diamati baik pada UV 365 dan UV 254. hRf rutin: 63 dan hRf fraksi etil asetat: 64. Hal tersebut diatas menunjukkan dalam fraksi etil asetat terdapat flavonoid, dapat dilihat dari warna bercak yang sama dan hRf yang berdekatan. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 hRf 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 hRf 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 hRf Gambar 11 Foto kromatogram uji kualitatif flavonoid pada fraksi etil asetat dengan fase diam: selulosa, fase gerak: n-butanol-asam asetat-air 4:1:5 vv, deteksi: pereaksi semprot besi III klorida, pengembangan: 10 cm. Keterangan: A: cahaya tampak, B: UV 365, C: UV 254

1: rutin, 2: fraksi etil asetat

Penyemprotan dengan besi III klorida memberikan kromatogram dengan empat bercak, tiga bercak berasal dari fraksi etil asetat dan yang satu adalah rutin yang digunakan sebagai pembanding. Rutin dengan warna coklat kekuningan memberikan hRf: 68. Untuk fraksi etil asetat ketiga bercak memberikan warna yang berbeda-beda. Bercak a berwarna ungu dengan hRfa: 69, untuk bercak b dan c berwarna biru tua dengan hRfb: 85 dan hRfc: 95. Hal tersebut diatas menunjukkan dalam fraksi etil asetat terdapat flavonoid, dapat dilihat dari hRf yang berdekatan antara bercak a dan rutin. Bercak b dan c diperkirakan masuk dalam golongan flavonol kuersetin atau erictodiol. Kesimpulan dalam analisis kualitatif ini adalah dalam buah ketapang terdapat flavonoid yang tersari dalam fraksi etil asetat. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

F. Optimasi Metode 1. Penentuan waktu operasi

Penentuan waktu operasi operating time bertujuan untuk mendapatkan waktu pengukuran absorbansi dengan nilai stabil. Waktu operasi ditentukan pada saat terbentuknya warna yang stabil, ditandai dengan nilai absorbansi yang stabil dari senyawa yang diukur. Penentuan waktu operasi dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan kontrol dengan tujuan mendapatkan waktu operasi senyawa kromogen MDA-TBA tanpa adanya gangguan senyawa lain. Pengukuran absorbansi setelah larutan kontrol diinkubasi pada suhu 80 o C kemudian didinginkan 5 menit dibawah air mengalir. Waktu pengukuran absorbansi kontrol adalah 30 menit. Hasil pengukuran absorbansi menunjukkan pada menit ke 0 sampai menit ke 30 memberikan nilai absorbansi yang stabil, yaitu 0,981. Kestabilan nilai absorbansi menunjukkan bahwa jumlah kromogen MDA- TBA relatif stabil. Reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA dipercepat dengan adanya panas. Pada penelitian ini, panas yang diterima larutan berasal dari pemanasan dengan waterbath pada suhu 80 o C. Setelah 30 menit melalui tahap pemanasan, larutan didinginkan selama 5 menit sehingga suhu larutan sama dengan suhu lingkungan . Ketiadaan panas ini memperlambat reaksi pembentukan kromogen MDA-TBA. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Gambar 12. Kurva hubungan waktu menit dengan absorbansi kromogen MDA-TBA Pada metode deoksiribosa, proses degradasi deoksiribosa menjadi MDA terjadi pada saat larutan campuran diinkubasi pada suhu 37 o C. Selanjutnya penambahan TCA menyebabkan larutan dalam suasana asam pH rendah. MDA kemudian akan bereaksi dengan TBA membentuk kromogen MDA-TBA. Selain memberikan suasana asam TCA menghambat proses oksidasi vitamin C sehingga proses reduksi Fe 3+ menjadi Fe 2+ terhambat pula. Terhambatnya reaksi ini mengakibatkan terhambatnya pembentukan radikal hidroksil sehingga terjadi penurunan kecepatan degradasi deoksiribosa oleh radikal hidroksil. Reaksi yang terjadi sebagai berikut. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Fe 3+ EDTA + Asam Askorbat Fe 2+ EDTA + Asam Dehidro Askorbat Fe 2+ EDTA + H 2 O 2 Fe 3+ EDTA + - OH + . OH Radikal hidroksil yang terjadi akan menyerang deoksiribosa dengan cara abstraksi pemisahan hidrogen dan membentuk suatu radikal deoksiribosa kemudian dengan adanya oksigen akan secara cepat diubah menjadi radikal gula peroksil. Selanjutnya radikal gula peroksil akan mengalami serangkaian reaksi yang meliputi disproposionasi, penataan ulang, eliminasi air dan pemecahan ikatan C-C menjadi malondialdehid MDA dan produk yang lain Purwantoko, 2007. Selain memberikan suasana asam, penambahan TCA berfungsi sebagai katalis pembentukan kromogen MDA-TBA. Adanya H + mengakibatkan pengubahan salah satu gugus keton pada TBA menjadi lebih reaktif sehingga TBA dapat bereaksi dengan MDA. N N O O S H H H N N O O S H H H H H + H Gambar 13. Reaksi pembentukan gugus enol pada TBA PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI O H 2 C OH H HO OH H OH O OH H 2 C HO H OH H 2 O O OH H 2 C HO H OH H O O H 2 C HO H OH H H OH O H 2 C O OH H H OH O H 2 C OH H 2 O H - H 2 O OH O H 2 C OH oksidasi H O O H HO OH O H O O H H OH H O O H malondialdehid OH deoksiribosa Gambar 14. Reaksi pembentukan MDA PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI N N O O H H H H S N N O O H H H H S H O H O N N O O H H H S OH H O TBA TBA MDA +H N N O H H S H OH S N N O H H H H H O O S N N O H H S N N O H H H OH H H OH O O +H +H N N O O H H S H H S N N O H H H O N N O H H S H S N N O O H H O +H N N OH H H S N N OH H H S H OH HO N N OH S N N OH HS OH HO + + H - H 2 O - H 2 O + + H + H MDA-TBA warna merah muda Gambar 15. Mekanisme reaksi pembentukan MDA-TBA Purwantoko, 2006 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Senyawa MDA yang dihasilkan dari reaksi degradasi deoksiribosa merupakan senyawa yang tidak berwarna. Reaksi pengkoplingan MDA dengan TBA membentuk kromogen yang berwarna merah muda. Warna ini terbentuk karena ada perpanjangan gugus kromofor dan penambahan gugus auksokrom. N N N N S OH HO OH OH HS gugus kromofor gugus auksokrom Gambar 16. Struktur kromogen MDA-TBA

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum

Menurut Kunchandy dan Rao 1998, panjang gelombang serapan maksimum teoritis kromogen MDA-TBA adalah 532 nm. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dalam penelitian ini dilakukan untuk verifikasi terhadap panjang gelombang serapan maksimum teoritis karena terdapat beberapa kondisi percobaan yang berbeda antara penelitian ini dengan penelitian yang pernah dilakukan. Perbedaan itu antara lain perbedaan waktu, iklim dan perbedaan individu yang melakukan. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum menggunakan larutan kontrol, yaitu larutan tanpa penambahan sampel dengan tujuan mendapatkan panjang gelombang maksimum kromogen MDA-TBA yang berwarna merah muda tanpa gangguan senyawa lain yang ada dalam sampel. Dari hasil scanning PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI yang dilakukan pada panjang gelombang 400-600 nm didapatkan panjang gelombang maksimum untuk kromogen MDA-TBA dalam penelitian ini adalah 532,2 nm. Panjang gelombang yang didapat mendekati panjang gelombang teoritis yaitu 532nm. Selisih panjang gelombang teoritis dengan hasil penelitian adalah 0,2 nm, selisih nilai ini masih memenuhi selisih yang diperbolehkan dalam Farmakope Indonesia Edisi IV, yaitu kurang dari 2 nm. Karena hal diatas, panjang gelombang yang diperoleh dapat digunakan dalam penelitian. Gambar 17. Kurva hubungan panjang gelombang nm dengan absorbansi kromogen MDA-TBA Panjang gelombang serapan maksimum merupakan faktor penting di dalam analisis kimia dengan metode spektrofotometri UV-Vis. Tujuan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI menentukan panjang gelombang maksimum dalam penelitian ini adalah untuk mencari panjang gelombang saat kromogen MDA-TBA dapat memberikan serapan yang optimum. Panjang gelombang yang didapat akan digunakan untuk mengukur serapan kompleks yang dianalisis. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum dapat digunakan untuk identifikasi molekul yang bersifat karakteristik. Panjang gelombang maksimum tidak tergantung pada struktur molekul suatu senyawa tetapi bergantung pada gugus molekul yang mengabsorbsi radiasi sinar UV-Vis sehingga jika ada dua senyawa dengan spektra UV-Vis yang sama, belum tentu kedua senyawa tersebut sama. Hal inilah yang menyebabkan panjang gelombang maksimum digunakan sebagai data sekunder dalam analisis kualitatif. Dalam analisis kuantitatif, pengukuran absorbansi dilakukan pada panjang gelombang serapan maksimum karena perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar, sehingga akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimum. Selain itu kurva serapan disekitar panjang gelombang serapan maksimum tersebut relatif lebih datar sehingga jika dilakukan pengukuran ulang atau replikasi, kemungkinan kesalahan yang terjadi makin kecil Mulja dan Suharman, 1995.

G. Hasil Uji Aktivitas Penangkapan Radikal Hidroksil dengan Metode Deoksiribosa

Metode deoksiribosa yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan prosedur kerja maupun konsentrasi mengarah pada penelitian Purwantoko 2006. Berdasarkan penelitian Purwantoko 2006, metode deoksiribosa memilki akurasi, PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI presisi dan linearitas yang baik sehingga dapat digunakan untuk menguji aktivitas penangkapan radikal hidroksil. Berdasarkan tabel IV, absorbansi larutan kontrol lebih tinggi daripada larutan sampel karena pada larutan kontrol tidak terdapat senyawa penangkap radikal hidroksil sehingga deoksiribosa langsung didegradasi oleh radikal hidroksil. Pada larutan sampel, dimungkinkan terdapat senyawa penangkap radikal hidroksil yang mengakibatkan penurunan jumlah degradasi deoksiribosa. Terbukti dengan adanya penurunan absorbansi kromogen MDA-TBA dari larutan sampel pada berbagai konsentrasi. Tabel IV. Absorbansi kromogen MDA-TBA pada penambahan fraksi etil asetat buah ketapang dengan berbagai konsentrasi Replikasi Konsentrasi fraksi etil asetat buah ketapang mgmL 0,033 0,067 0,100 0,133 0,167 I 1,070 0,448 0,436 0,426 0,405 0,387 II 1,072 0,515 0,448 0,413 0,365 0,330 III 1,071 0,582 0,559 0,509 0,455 0,438 IV 1,070 0,545 0,510 0,461 0,431 0,405 V 1,073 0,577 0,535 0,516 0,478 0,451 VI 1,071 0,582 0,552 0,526 0,486 0,457 Rata-rata 1,071 0,542 0,507 0,475 0,437 0,411 SD 0,001 0,048 0,053 0,049 0,046 0,048 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 0.0 0.4 0.8 0.05 0.1 0.15 0.2 konsentrasi mgml ab s o rb an si 1.2 Gambar 18. Kurva hubungan antara penambahan konsentrasi fraksi etil asetat buah ketapang dengan absorbansi kromogen MDA-TBA Semakin besar konsentrasi fraksi etil asetat yang ditambahkan maka terjadi penurunan absorbansi. Penurunan absorbansi ini disebabkan peristiwa penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat buah ketapang. Peristiwa ini mengakibatkan penurunan jumlah radikal hidroksil yang akan mendegradasi deoksiribosa akibatnya terjadi penurunan MDA. Adanya penurunan jumlah MDA mengakibatkan penurunan jumlah kromogen MDA-TBA yang ditunjukkan dengan penurunan absorbansi larutan dengan sampel pada berbagai konsentrasi dibandingkan dengan larutan kontrol. Nilai aktivitas penangkapan radikal hidroksil oleh fraksi etil asetat dinyatakan dalam persen scavenging. Nilai persen scavenging dihitung dari selisih antara purata absorbansi sampel fraksi etil asetat pada konsentrasi tertentu, dibagi purata absorbansi blangko dikalikan 100. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Tabel V. Persen scavenging fraksi etil asetat buah ketapang Konsentrasi Fraksi Etil Asetat mgmL Scavenging Fraksi Etil Asetat Buah Ketapang Persamaan Regresi Linear 0,033 46,51 Y= 96,711 X + 43,289 A = 43,289 B = 96,711 r = 0,9985 0,067 49,66 0,100 52,83 0,133 56,61 0,167 59,19 20 40 60 80 0.05 0.1 0.15 0.2 konsentrasi mgml sc aveng in g Gambar 19. Kurva hubungan kenaikan konsentrasi fraksi etil asetat dengan scavenging Persamaan regresi linear yang didapat adalah Y= 96,711X + 43,289 dengan r = 0,9985 lebih besar dari r tabel db = 4; P’ = 0,05, sebesar 0,811 Muth, 1999, sehingga persamaan di atas dapat digunakan untuk menghitung nilai ES 50 dari fraksi etil asetat buah ketapang. Nilai ES 50 berbanding terbalik dengan kemampuan senyawa untuk menangkap radikal hidroksil. Semakin kecil nilai ES 50 maka sampel tersebut mempunyai nilai keefektifan sebagai penangkap radikal hidroksil sebagai antioksidan yang lebih baik. Nilai ES 50 fraksi etil asetat buah ketapang 0,06939 mgmL = 69,39 µgmL. Hal ini menunjukkan bahwa dengan konsentrasi 69,39 µgmL fraksi etil asetat buah ketapang dapat menangkap 50 radikal hidroksil yang terdapat dalam larutan. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Jika dibandingkan dengan ES 50 fraksi etil asetat teh hijau sebesar 0,22 mgml Dewi, 2007 dan ES 50 fraksi etil asetat teh hitam sebesar 0,22 mgml Leny, 2007, fraksi etil asetat buah ketapang mempunyai nilai keefektifan sebagai penangkap radikal hidroksil sebagai antioksidan yang lebih baik. Hal ini dikarenakan nilai ES 50 fraksi etil asetat buah ketapang, yaitu sebesar 69,39 µgmL lebih kecil dibandingkan ES 50 fraksi etil asetat teh hijau dan teh hitam. Flavonoid yang terdapat dalam fraksi etil asetat buah ketapang dapat mempengaruhi aktivitasnya sebagai antioksidan. Karena flavonoid yang terkandung dalam fraksi etil asetat dalam bentuk aglikon dan yang terikat gula. Mekanisme penangkapan radikal hidroksil oleh flavonoid dalam fraksi etil asetat disebabkan karena terdapat gugus hidroksi fenolik dalam struktur molekulnya. Gugus ini berperan besar dalam mendonorkan atom hidrogennya ketika diserang oleh radikal hidroksil, flavonoid-flavonoid tersebut akan membentuk radikal bebas baru yang lebih stabil yaitu radikal fenoksil FIO • dan molekul air yang stabil. FIOH + • OH FIO • + H 2 O Radikal fenoksil tersebut akan mengalami efek resonansi pada cincin aromatiknya, hal inilah yang menyebabkan radikal fenoksil lebih stabil daripada radikal hidroksil. Radikal fenoksil juga akan melakukan terminasi yaitu penggabungan dengan radikal bebas lain. Reaksi terminasi ini dapat terjadi antara radikal fenoksil dengan radikal hidroksil maupun dengan radikal fenoksil lainnya. FIO • + • OH FIO-OH FIO • + FIO • FIO-FIO PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Fase propagasi dari radikal hidroksil dapat dihambat karena flavonoid memiliki kemampuan menangkap radikal hidroksil. Hal inilah yang menyebabkan berkurangnya radikal hidroksil yang menyerang deoksiribosa ketika penambahan fraksi etil asetat buah ketapang ke dalam campuran pereaksi fenton dan deoksiribosa. Setiap konsentrasi fraksi etil asetat meningkat, absorban yang terbaca menjadi menurun. Hal ini menunjukkan semakin meningkat konsentrasi berarti semakin banyak flavonoid yang terkandung di dalamnya, sehingga radikal hidroksil yang akan menyerang deoksiribosa akan semakin berkurang. Menyebabkan deoksiribosa yang didegradasi berkurang, sehingga kromogen MDA-TBA yang terbentuk juga semakin sedikit dan menyebabkan ansorbansinya berkurang. O O OH O O H O OH OH O O O OH O O O OH O + H 2 O G ambar 20. Mekanisme penegkapan radikal hidroksil oleh flavonoid dan efek resonansi yang terjadi pada flavonoid PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI O OH O O O HO O O O O

H. Penentuan Kadar Senyawa Flavonoid Total