16
laurat pNP laurat sebagai substrat. Stok substrat diperoleh dengan cara melarutkan 0.08 bv pNP laurat dalam 5mM sodium asetat pH 5.0 yang mengandung 1 triton X-100 dan dipanaskan pada air
mendidih selama 1 menit agar dihasilkan larutan yang sempurna kemudian didinginkan pada suhu ruang.
Campuran pereaksi terdiri dari blanko, kontrol A, kontrol B, dan sampel atau kontrol positif. Kontrol A digunakan untuk mengetahui absorbansi dari pNp produk hidrolisis berwarna kuning ketika
reaksi berlangsung optimal tanpa adanya senyawa penghambat dari ekstrak teh hitam, sedangkan sampel digunakan untuk mengetahui absorbansi dari pNp ketika reaksi berlangsung dengan adanya
senyawa penghambat dari ekstrak teh hitam. Blanko digunakan untuk mengetahui absorbansi dari substrat awal tanpa adanya ekstrak teh hitam sedangkan kontrol B digunakan untuk mengetahui
absorbansi dari substrat awal ditambah ekstrak teh hitam. Tabel 6 menunjukkan kombinasi jumlah ekstrak atau orlistat, buffer Tris, dan enzim yang diberikan pada blanko, kontrol A, kontrol B, dan
sampel atau kontrol positif Orlistat. Masing-masing campuran reaksi diinkubasi pada 37
o
C selama 2 jam. Reaksi dihentikan dengan memasukkan campuran reaksi ke dalam penangas air suhu 100
o
C selama 5 menit. Selanjutnya aquades ditambahkan pada campuran reaksi kemudian agar padatan dalam larutan
tidak mengganggu pembacaan absorbansi, larutan disentrifugasi pada 4000 rpm selama 15 menit dan dibaca menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 410 nm.
Tabel 6. Komposisi larutan pereaksi uji inhibisi enzim lipase
Larutan Blanko
Kontrol A Kontrol B
Sampel Ekstrak
μL
- -
50 50
Buffer μL
400 400
400 400
Enzim μL
- 150
- 150
Substrat p-Nitrofenil laurat
μL
450 450
450 450
Aquades μL
4150 4000
4100 3950
Sumber: McDougall et al. 2009 modifikasi Aktivitas inhibisi sampel dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:
inhibisi =
Keterangan: A1 = Absorbansi kontrol A - Absorbansi blanko A2 = Absorbansi sampel - Absorbansi kontrol B
d. Analisis Statistik
Data-data yang diperoleh dianalisis secara statistik menggunakan Rancangan Acak Lengkap dua faktor Univariate Analysis, Rancangan Faktorial One Way Anova, dan uji beda berpasangan T-
Test Praid serta uji korelasi Pearson Correlation. RAL dua faktor Univariate Analysis dilakukan untuk mengetahui pengaruh perlakuan penyeduhan terhadap daya inhibisi, nilai pH awal, total fenol,
dan kadar tanin terkondensasi ekstrak teh hitam. Jika perlakuan memberikan pengaruh yang nyata, maka pengujian dilanjutkan dengan analisis beda Duncan pada taraf 5 untuk mengetahui pengaruh antar
perlakuan. Rancangan Faktorial One Way Anova dilakukan untuk membandingkan daya inhibisi enzim lipase ekstrak teh hitam dengan Orlistat. Uji t-test dua berpasangan digunakan untuk mengetahui
pengaruh simulasi pH pencernaan pada ekstrak teh hitam terhadap daya inhibisi enzim lipase, total fenol, dan kadar tanin terkondensasi. Uji korelasi digunakan untuk mengetahui hubungan antara daya
inhibisi dengan total fenol dan daya inhibisi dengan kadar tanin terkondensasi ekstrak teh hitam.
17
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Ekstraksi Teh Hitam
Ekstraksi merupakan suatu proses penyarian zat-zat aktif pada tanaman yang bertujuan untuk menarik komponen kimia yang ada dengan menggunakan pelarut tertentu. Proses ekstraksi teh
dilakukan dengan cara penyeduhan. Penyarian zat-zat aktif dari dalam matriks teh hitam akan berlangsung melalui proses difusi. Menurut Astill et al. 2001, perbedaan cara penyeduhan teh dapat
memengaruhi komposisi senyawa kimia yang terdapat pada produk akhir minuman teh. Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa total padatan terlarut seperti komponen polifenol dan kafein akan
semakin meningkat seiring meningkatnya konsentrasi teh, padatan terlarut terekstrak dengan cepat pada menit pertama penyeduhan tetapi menurun secara bertahap dengan meningkatnya waktu penyeduhan,
dan suhu penyeduhan yang direkomendasikan untuk menyeduh teh hitam adalah 100
o
C, lebih tinggi daripada teh hijau 75-90
o
C. Komposisi senyawa kimia minuman teh akan berpengaruh langsung terhadap kualitas minuman teh dan manfaat kesehatan yang dihasilkan. Hal ini didukung pula oleh
Madsuda di dalam Ho et al. 2009 yang menyatakan bahwa perbedaan cara penyeduhan teh akan memengaruhi flavor dan cita rasa yang terbentuk.
Suhu penyeduhan dan waktu penyeduhan merupakan dua faktor yang sangat menentukan komposisi senyawa kimia yang terekstrak dari teh hitam. Oleh karena itu, kedua faktor tersebut
dijadikan perlakuan dalam penelitian ini. Perlakuan penyeduhan yang dilakukan ialah penyeduhan teh hitam pada suhu awal 70
o
C, 85
o
C, dan 100
o
C dengan waktu penyeduhan masing-masing 5, 10, dan 15 menit. Konsentrasi teh yang digunakan adalah 0,02 gml 2 gram teh ditambah 100 ml air pada semua
perlakuan penyeduhan. Konsentrasi 0,02 gml dipilih sesuai dengan saran penyajian teh dengan tujuan mendapatkan cita rasa dan manfaat dari teh Pettigrew 2009; Laresolo 2007. Walaupun demikian,
konsentrasi tersebut tidaklah bersifat mutlak karena setiap orang memiliki selera yang berbeda terhadap cita rasa dan tujuan yang berbeda pula ketika mengkonsumsi teh. Disisi lain, Gondoin et al. 2010
menyatakan bahwa diperlukan konsentrasi yang lebih tinggi dari 0,01 gml untuk mendapatkan daya penghambatan teh hitam terhadap enzim lipase pankreas.
Variasi suhu penyeduhan didasarkan atas kebiasaan masyarakat dalam menyeduh teh sehari- hari. Pada umumnya, masyarakat menggunakan air mendidih untuk menyeduh teh dimana suhu air
mendidih adalah sekitar 100
o
C. Suhu penyeduhan 70
o
C diperoleh dari kebiasaan masyarakat kota yang sering menggunakan air panas yang berasal dari dispenser untuk menyeduh teh dimana suhu air tersebut
adalah sekitar 70
o
C. Suhu penyeduhan 85
o
C dipilih sebagai suhu antara suhu 70
o
C dan 100
o
C. Sementara itu, waktu penyeduhan divariasikan untuk mendapatkan komposisi komponen bioaktif
terekstrak yang mungkin memiliki kemampuan yang berbeda dalam menghambat enzim lipase. Menurut Astill et al. 2001, senyawa-senyawa kimia seperti polifenol, kafein, tanin, dan theaflavin
meningkat jumlahnya dengan cepat hingga batas tertentu dan menurun secara bertahap seiring meningkatnya suhu dan waktu penyeduhan teh hitam.
Ekstrak teh hitam yang dihasilkan dibedakan atas perlakuan yang diberikan, yaitu kombinasi suhu dan waktu penyeduhan. Berdasarkan hal tersebut, terdapat sembilan ekstrak yang berbeda.
Disebabkan oleh suhu penyeduhan yang menurun seiring lamanya waktu penyeduhan maka dilakukan pengecekan suhu akhir. Pengecekan suhu akhir juga dimaksudkan untuk mengetahui kisaran temperatur
selama penyeduhan. Data-data tersebut dapat dilihat pada Tabel 7. Kesembilan ekstrak ini disebut ekstrak awal yang kemudian sebagian akan dianalisis daya inhibisi enzim lipase, total fenol, dan kadar
tanin terkondensasi dan sebagian lainnya akan diberi perlakuan simulasi pH pencernaan.
