15
molybdenum-blue berwarna biru yang dapat terukur secara spektrofotometri sinar tampak pada panjang gelombang 725 nm.
Larutan standar asam galat dibuat pada berbagai konsentrasi, yaitu 50, 100, 150, 200, dan 250 ppm. Pengujian ini menggunakan reagen Folin Ciocalteu 50 dan pereaksi Na
2
CO
3
5. Pertama-tama, larutan standar atau ekstrak teh sebanyak 0.5 ml dilarutkan bersama 2.5 ml reagen Folin Ciocalteu, 0.5
ml etanol, dan 2.5 ml akuades di dalam tabung reaksi. Setelah itu, larutan didiamkan selama 5 menit dalam ruang gelap dan kemudian ditambahkan 0.5 ml peraksi Na
2
CO
3
, dan diinkubasi kembali dalam ruang gelap selama 1 jam. Setelah inkubasi, larutan divorteks dan diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 725 nm menggunakan spektrofotometer.
b. Kadar Tanin Terkondensasi
Pengujian ini dilakukan mengikuti prosedur Porter et al. 1986. Metode pengukuran kadar tanin terkondensasi didasarkan atas reaksi pembentukan warna dari kompleks tanin dengan ion Fe
3+
, yang kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang
500 nm. Peraksi yangdigunakan dalam uji ini terdiri dari Butanol-HCl butanol-HCl 37, 95:5 vv dan reagen ferric 2 ferric ammonium sulfat dalam 2N HCl.
Ekstrak teh sebanyak 0.5 ml dilarutkan bersama 3 ml butanol-HCl dan 0.1 ml reagen ferric di dalam tabung reaksi bertutup, lalu divortex. Kemudian tabung reaksi tersebut dipanaskan di dalam
waterbath pada suhu air mendidih selama 60 menit. Setelah itu, tabung reaksi didinginkan hingga mencapai suhu ruang dan kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 550 nm. Tanin terkondensasi berat kering sebagai Leucocyanidin Equivalent LE akan dihitung
berdasarkan rumus: A 550nm x 78.26 x pengenceran berat kering
Rumus tersebut mengasumsikan bahwa E1 paling efektif dari leucocyanidin pada panjang gelombang 550 nm menggunakan kuvet dengan tebal 1 cm adalah 460 Porter et al. 1986.
c. Inhibisi Enzim Lipase
Pengujian ini dilakukan mengikuti prosedur Mc Dougall et al. 2009 untuk mengetahui aktivitas penghambatan enzim lipase yang berasal dari pankreas babi tipe II Sigma L3126. Pemecahan
substrat p-nitrofenil laurat menjadi p-nitrofenil berwarna kuning dan laurat oleh enzim lipase Gambar 10. Aktivitas penghambatan diukur berdasarkan jumlah p-nitrofenil yang dihasilkan dengan mengukur
absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 410 nm. Kontrol positif yang digunakan pada pengujian ini adalah Orlistat 1.2 mgml yang diperoleh pelarutan 1 tablet xenical 120
mg orlistat dalam 100 ml aquades.
Gambar 10. Reaksi hidrolisis pNp Laurat Mc Dougall et al. 2009 Lipase pankreas babi tipe II Sigma L3126 dilarutkan dalam aquades 10mgml. Pengujian
dilakukan secara in vitro, dimana Tris buffer pH 8.2 100 mM digunakan sebagai buffer dan p-nitrofenil
16
laurat pNP laurat sebagai substrat. Stok substrat diperoleh dengan cara melarutkan 0.08 bv pNP laurat dalam 5mM sodium asetat pH 5.0 yang mengandung 1 triton X-100 dan dipanaskan pada air
mendidih selama 1 menit agar dihasilkan larutan yang sempurna kemudian didinginkan pada suhu ruang.
Campuran pereaksi terdiri dari blanko, kontrol A, kontrol B, dan sampel atau kontrol positif. Kontrol A digunakan untuk mengetahui absorbansi dari pNp produk hidrolisis berwarna kuning ketika
reaksi berlangsung optimal tanpa adanya senyawa penghambat dari ekstrak teh hitam, sedangkan sampel digunakan untuk mengetahui absorbansi dari pNp ketika reaksi berlangsung dengan adanya
senyawa penghambat dari ekstrak teh hitam. Blanko digunakan untuk mengetahui absorbansi dari substrat awal tanpa adanya ekstrak teh hitam sedangkan kontrol B digunakan untuk mengetahui
absorbansi dari substrat awal ditambah ekstrak teh hitam. Tabel 6 menunjukkan kombinasi jumlah ekstrak atau orlistat, buffer Tris, dan enzim yang diberikan pada blanko, kontrol A, kontrol B, dan
sampel atau kontrol positif Orlistat. Masing-masing campuran reaksi diinkubasi pada 37
o
C selama 2 jam. Reaksi dihentikan dengan memasukkan campuran reaksi ke dalam penangas air suhu 100
o
C selama 5 menit. Selanjutnya aquades ditambahkan pada campuran reaksi kemudian agar padatan dalam larutan
tidak mengganggu pembacaan absorbansi, larutan disentrifugasi pada 4000 rpm selama 15 menit dan dibaca menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 410 nm.
Tabel 6. Komposisi larutan pereaksi uji inhibisi enzim lipase
Larutan Blanko
Kontrol A Kontrol B
Sampel Ekstrak
μL
- -
50 50
Buffer μL
400 400
400 400
Enzim μL
- 150
- 150
Substrat p-Nitrofenil laurat
μL
450 450
450 450
Aquades μL
4150 4000
4100 3950
Sumber: McDougall et al. 2009 modifikasi Aktivitas inhibisi sampel dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:
inhibisi =
Keterangan: A1 = Absorbansi kontrol A - Absorbansi blanko A2 = Absorbansi sampel - Absorbansi kontrol B
d. Analisis Statistik
