Kadar Tanin Terkondensasi Analisis
16
laurat pNP laurat sebagai substrat. Stok substrat diperoleh dengan cara melarutkan 0.08 bv pNP laurat dalam 5mM sodium asetat pH 5.0 yang mengandung 1 triton X-100 dan dipanaskan pada air
mendidih selama 1 menit agar dihasilkan larutan yang sempurna kemudian didinginkan pada suhu ruang.
Campuran pereaksi terdiri dari blanko, kontrol A, kontrol B, dan sampel atau kontrol positif. Kontrol A digunakan untuk mengetahui absorbansi dari pNp produk hidrolisis berwarna kuning ketika
reaksi berlangsung optimal tanpa adanya senyawa penghambat dari ekstrak teh hitam, sedangkan sampel digunakan untuk mengetahui absorbansi dari pNp ketika reaksi berlangsung dengan adanya
senyawa penghambat dari ekstrak teh hitam. Blanko digunakan untuk mengetahui absorbansi dari substrat awal tanpa adanya ekstrak teh hitam sedangkan kontrol B digunakan untuk mengetahui
absorbansi dari substrat awal ditambah ekstrak teh hitam. Tabel 6 menunjukkan kombinasi jumlah ekstrak atau orlistat, buffer Tris, dan enzim yang diberikan pada blanko, kontrol A, kontrol B, dan
sampel atau kontrol positif Orlistat. Masing-masing campuran reaksi diinkubasi pada 37
o
C selama 2 jam. Reaksi dihentikan dengan memasukkan campuran reaksi ke dalam penangas air suhu 100
o
C selama 5 menit. Selanjutnya aquades ditambahkan pada campuran reaksi kemudian agar padatan dalam larutan
tidak mengganggu pembacaan absorbansi, larutan disentrifugasi pada 4000 rpm selama 15 menit dan dibaca menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 410 nm.
Tabel 6. Komposisi larutan pereaksi uji inhibisi enzim lipase
Larutan Blanko
Kontrol A Kontrol B
Sampel Ekstrak
μL
- -
50 50
Buffer μL
400 400
400 400
Enzim μL
- 150
- 150
Substrat p-Nitrofenil laurat
μL
450 450
450 450
Aquades μL
4150 4000
4100 3950
Sumber: McDougall et al. 2009 modifikasi Aktivitas inhibisi sampel dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:
inhibisi =
Keterangan: A1 = Absorbansi kontrol A - Absorbansi blanko A2 = Absorbansi sampel - Absorbansi kontrol B