meskipun suhu optimum bagi aktifitas enzim adalah 72 C. Setelah terjadi
annealing selanjutnya dilakukan perbanyakan fragmen DNA melalui proses ekstensi pada suhu 72
C. Seleksi primer dimaksudkan untuk mencari primer acak yang
menghasilkan penanda polimorfik, karena tidak semua primer nukleotida dapat menghasilkan produk amplifikasi primer positif dan dari primer positif tidak
semuanya menghasilkan fragmen DNA polimorfik. Proses penyeleksian primer yang digunakan dalam metoda mikrosatellite mengikuti primer yang pernah diuji
oleh Nurtjahjaningsih et al. 2005, karena belum ada penelitian pendahuluan terhadap jenis P. merkusii alami yang dapat mengamplifikasi DNA tanaman ini.
Dalam penelitian ini digunakan 7 primer yang dipilih dari hasil temuan mikrosatelit pada P. merkusii di hutan tanaman Nurtjahjaningsih et al. 2005.
Informasi tentang ketujuh primer mikrosatelit tersebut tersaji pada Tabel 4. Tabel 4 Karakteristik primer mikrosatelit dari Pinus merkusii di hutan tanaman,
di Pulau Jawa Nurtjahjaningsih et al. 2005
4. PCR Polymerase Chain Reaction
Proses PCR membutuhkan 4 komponen utama yaitu H
2
O, HotStar Mix, primer dan DNA. DNA hasil proses ektraksi sebelum dilakukan proses
amplifikasi PCR harus dilakukan pengenceran dengan menggunakan aquabidest. Besarnya perbandingan antara DNA dengan aquabidest tergantung dari tebal dan
tipisnya DNA hasil ekstraksi. Untuk proses PCR, DNA 1.5 µl dicampurkan dengan HotStar Mix 7.5 µl,
Nuclease-free water 2.5 µl dan primer 1.5 µl disentrifugasi selama 5-10 detik
Suhu Nomor Akses
annealing
o
C ke Bank Gen
1. pm01 111-117
56 TG
12
F: AGAGAAGGCACGATTTTGTC AB201535
R: TCCCACTAATCACTTTGAAAG 2. pm04
92 56
TG
10
F: CTCTAAGTAGGACAAGGCCT AB201536
R: CATAATCCAAGGAGTCAAGG 3. pm05
112-118 52
TG
9
F: GAGTCTAATTGCAAACCCCA AB201537
R: TGGAGATCTACCACTTTTTC 4. pm07
284-309 52
AC
8
AT
4
F: GAATCTAAGCATATGAAATGAG AB201538
R: CTTGTTAATGCTACTAGTTATG 5. pm08
132 59
AT
2
GT
11
F: GCTTCAATCTATTGACCCCAT AB201539
R: TAAAGGGGCAGCTGCTACAACCAATGG 6. pm09a
81-99 52
AT
5
GT
18
AT
2
F: CCTTCTCATTTCGATATGCAC AB201540
R: ATTAAAGGTTATATGGGGCT 7. pm12
181-193 59
GT
5
CTGT
5
AT
5
F: GAACAATCATTGCGGGTCCCG AB201541
R: TATGCTGCGTTTATATGTATAAGTGTC
Ukuran Produk bp Lokus
No Motif Pengulangan
Sekuen primer 5-3
kemudian dimasukkan kedalam mesin PCR. Tahapan serta suhu PCR seperti disajikan dalam Tabel 5.
Tabel 5 Tahapan dalam proses PCR
Metode Tahapan
Suhu C
Waktu menit Jumlah
siklus Mikrosatelit
Pre- Denaturation Denaturation
Annealing Extention
Final Extention 95
95 53
72 72
2 1
2 2
5 1
35 1
Pengujian polimorfisme dilakukan dengan melihat pita hasil PCR yang divisualisasi berdasarkan hasil elektroforesis. Hasil pengujian ini dikatakan
polimorfisme jika pola pita yang dihasilkan mempunyai sekurang-kurangnya lebih dari satu variasi, sedang hasil pengujian dikatakan monomorfik jika tidak
memperlihatkan adanya variasi pada pola pita hasil elektroforesis.
5. Analisis Data
Hasil PCR yang telah dielektroforesis difoto dan dianalisis dengan melakukan skoring pita yang muncul. Pada metode RAPD pola pita yang muncul
diterjemahkan kedalam data biner berdasarkan ada atau tidak adanya pita, sedangkan untuk data mikrosatelit dihitung berdasarkan banyaknya alel yang
ditemukan sesuai panjang basa. Hasil perhitungan pita-pita DNA tersebut kemudian dianalisis untuk
mengetahui keragaman dalam populasi maupun antar populasi. Parameter keragaman genetik yang dihitung dalam penelitian ini adalah Finkelday 2005 :
a. Persentase Lokus Polimorfik PLP Suatu lokus gen dikatakan polimorfik jika sekurang-kurangnya ada dua varian
yang berbeda alel. Sedang untuk monomorfik tidak memperlihatkan variasi genetik. Persentase lokus polimorfik dihitung dengan rumus;
Persentase Lokus Polimorfik PLP =
LM
LP LP
X 100 dimana
Σ LP ; jumlah lokus polimorfik ΣLM ; jumlah lokus monomorfik
b. Jumlah alel yang teramati na =
Lokus Alel
