sebanyak 10 µl, lalu sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 2 menit. Hasil sentrifugasi supernatan akan terpisah menjadi dua fase yaitu bagian atas
merupakan fase air yang berisi asam nukleat dan bagian bawah yaitu fase organik yang berisi pelarut organik. Fase air dipisahkan dari fase organik dengan
menggunakan pipet mikro lalu dipindahkan kedalam tabung mikro baru. Kemudian ditambahkan chloroform 500 µl dan fenol 10 µl sebanyak dua kali
secara berulang yang bertujuan untuk memperoleh DNA yang memiliki tingkat kemurnian tinggi.
Supernatan yang telah terpisah dari fase organik, ditambahkan isoproponal dingin sebanyak 500 µl dan NaCl atau NaOAc sebanyak 500 µl dan 300 µl.
Campuran ini disimpan dalam freezer selama 45 menit – 1 jam. Hasil
pengendapan tersebut disentrifuge pada kecepatan 13000 rpm selama 2 menit kemudian cairan dalam tabung mikro dibuang. Hasil pengendapan akan berupa
pelet DNA. Pelet DNA ini kemudian ditambahkan etanol 100 sebanyak 300 µl dan disentrifuge selama 2 menit pada kecepatan 13000 rpm, kemudian cairan
etanol tersebut dibuang. Setelah itu pelet DNA yang tersisa dalam tabung mikro dikeringkan dalam desikator dengan posisi terbalik selama 10 menit lalu
ditambahkan larutan TE sebanyak 20 µl difortex kemudian disimpan didalam freezer.
Selama proses pengeringan pelet DNA, disiapkan agarose 1 0.33 gram agarose dalam 33 ml TAE. Untuk proses elektroforesis, diambil 3 µl DNA
ditambahkan 2 µl blue juice 10 X dan kemudian di running pada tegangan 100 selama ± 30 menit. DNA akan bergerak kearah positif anoda. Hasil
elektroforesis kemudian direndam dalam larutan etidium Bromide ETBR 10 µl per 200 ml aquades selama 3
– 5 menit dan selanjutnya dilihat pada UV transiluminator.
3. Seleksi Primer
Primer adalah rantai pendek DNA yang dihasilkan secara buatan biasanya antara 10
– 25 nukleotida. Primer berfungsi sebagai titik mula terjadinya sintesis oleh enzim yang disebut DNA polymerase yang diperoleh dari bakteri Thermus
aquaticus. Enzim ini biasa disebut juga Taq DNA polymerase. Enzim ini sesuai untuk proses amplifikasi karena dapat bertahan pada suhu tinggi hingga 95
C
meskipun suhu optimum bagi aktifitas enzim adalah 72 C. Setelah terjadi
annealing selanjutnya dilakukan perbanyakan fragmen DNA melalui proses ekstensi pada suhu 72
C. Seleksi primer dimaksudkan untuk mencari primer acak yang
menghasilkan penanda polimorfik, karena tidak semua primer nukleotida dapat menghasilkan produk amplifikasi primer positif dan dari primer positif tidak
semuanya menghasilkan fragmen DNA polimorfik. Proses penyeleksian primer yang digunakan dalam metoda mikrosatellite mengikuti primer yang pernah diuji
oleh Nurtjahjaningsih et al. 2005, karena belum ada penelitian pendahuluan terhadap jenis P. merkusii alami yang dapat mengamplifikasi DNA tanaman ini.
Dalam penelitian ini digunakan 7 primer yang dipilih dari hasil temuan mikrosatelit pada P. merkusii di hutan tanaman Nurtjahjaningsih et al. 2005.
Informasi tentang ketujuh primer mikrosatelit tersebut tersaji pada Tabel 4. Tabel 4 Karakteristik primer mikrosatelit dari Pinus merkusii di hutan tanaman,
di Pulau Jawa Nurtjahjaningsih et al. 2005
4. PCR Polymerase Chain Reaction
Proses PCR membutuhkan 4 komponen utama yaitu H
2
O, HotStar Mix, primer dan DNA. DNA hasil proses ektraksi sebelum dilakukan proses
amplifikasi PCR harus dilakukan pengenceran dengan menggunakan aquabidest. Besarnya perbandingan antara DNA dengan aquabidest tergantung dari tebal dan
tipisnya DNA hasil ekstraksi. Untuk proses PCR, DNA 1.5 µl dicampurkan dengan HotStar Mix 7.5 µl,
Nuclease-free water 2.5 µl dan primer 1.5 µl disentrifugasi selama 5-10 detik
Suhu Nomor Akses
annealing
o
C ke Bank Gen
1. pm01 111-117
56 TG
12
F: AGAGAAGGCACGATTTTGTC AB201535
R: TCCCACTAATCACTTTGAAAG 2. pm04
92 56
TG
10
F: CTCTAAGTAGGACAAGGCCT AB201536
R: CATAATCCAAGGAGTCAAGG 3. pm05
112-118 52
TG
9
F: GAGTCTAATTGCAAACCCCA AB201537
R: TGGAGATCTACCACTTTTTC 4. pm07
284-309 52
AC
8
AT
4
F: GAATCTAAGCATATGAAATGAG AB201538
R: CTTGTTAATGCTACTAGTTATG 5. pm08
132 59
AT
2
GT
11
F: GCTTCAATCTATTGACCCCAT AB201539
R: TAAAGGGGCAGCTGCTACAACCAATGG 6. pm09a
81-99 52
AT
5
GT
18
AT
2
F: CCTTCTCATTTCGATATGCAC AB201540
R: ATTAAAGGTTATATGGGGCT 7. pm12
181-193 59
GT
5
CTGT
5
AT
5
F: GAACAATCATTGCGGGTCCCG AB201541
R: TATGCTGCGTTTATATGTATAAGTGTC
Ukuran Produk bp Lokus
No Motif Pengulangan
Sekuen primer 5-3
kemudian dimasukkan kedalam mesin PCR. Tahapan serta suhu PCR seperti disajikan dalam Tabel 5.
Tabel 5 Tahapan dalam proses PCR
Metode Tahapan
Suhu C
Waktu menit Jumlah
siklus Mikrosatelit
Pre- Denaturation Denaturation
Annealing Extention
Final Extention 95
95 53
72 72
2 1
2 2
5 1
35 1
Pengujian polimorfisme dilakukan dengan melihat pita hasil PCR yang divisualisasi berdasarkan hasil elektroforesis. Hasil pengujian ini dikatakan
polimorfisme jika pola pita yang dihasilkan mempunyai sekurang-kurangnya lebih dari satu variasi, sedang hasil pengujian dikatakan monomorfik jika tidak
memperlihatkan adanya variasi pada pola pita hasil elektroforesis.
5. Analisis Data
