Ekstraksi DNA Analysis of land cover changes, genetic structure, and carbon biomass stock of pinus Merkusii Jungh Et De Vriese Strain Tapanuli In Its Natural Distribution In North Sumatra

Metode 1. Pengambilan Sampel Unit sampel untuk analisis genetik ini adalah populasi. Di dalam penelitian ini ada 5 populasi alam P. merkusii strain Tapanuli yang menyebar pada lokasi yang berbeda tetapi masih di dalam ekosistem hutan Tapanuli. Informasi kelima lokasi sebaran disajikan pada Tabel 1. Jumlah pohon yang dijadikan sampel untuk setiap lokasi populasi alam diupayakan mencapai 24-30 individu pohon, sedangkan sampel yang diambil untuk analisis genetika ini berupa daun. Prosedur pengambilan sampel di lapangan adalah sebagai berikut: a. Daun diambil dari setiap individu pohon sebanyak 2 – 5 pucuk daun. b. Daun tersebut selanjutnya dimasukkan ke dalam plastik klips yang berisi silika gel. c. Dalam satu lokasi diharapkan dapat dijumpai 24 - 30 d. Setiap pohon yang daunnya diambil diukur tinggi, diameter dan letak geografisnya dengan menggunakan alat ukur e. Jarak antar pohon sampel dalam satu populasi minimal 30 meter f. Data mengenai tinggi, diameter dan letak geografis, serta pemetaan pohon induk maupun anakan dicatat kedalam lembar data datasheet.

2. Ekstraksi DNA

Metode yang digunakan untuk ekstraksi DNA ini adalah metode CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide yang telah dimodifikasi. Daun dipotong dengan ukuran 2 X 2 cm, kemudian digerus dengan menambahkan nitrogen cair di dalam pestelmortar yang bersih. Hasil gerusan kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml dan ditambahkan larutan buffer ekstrak sebanyak 500 – 700 µl. Agar daun hasil gerusan tercampur dengan larutan penyangga dan PVP 2 secara merata maka tabung yang berisi hasil gerusan tersebut di vortex. Setelah itu diinkubasi dalam dalam water bath selama 45 menit – 1 jam sambil dibolak-balik setiap 15 menit. Suhu optimal yang digunakan dalam proses inkubasi berkisar antara 65-70 C. Apabila proses inkubasi melebihi suhu optimal maka DNA yang ada dalam tube akan rusak. Setelah proses inkubasi, tabung mikro tersebut diangkat dan didinginkan selama 15 menit kemudian ditambahkan kloroform sebanyak 500 µl dan fenol sebanyak 10 µl, lalu sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 2 menit. Hasil sentrifugasi supernatan akan terpisah menjadi dua fase yaitu bagian atas merupakan fase air yang berisi asam nukleat dan bagian bawah yaitu fase organik yang berisi pelarut organik. Fase air dipisahkan dari fase organik dengan menggunakan pipet mikro lalu dipindahkan kedalam tabung mikro baru. Kemudian ditambahkan chloroform 500 µl dan fenol 10 µl sebanyak dua kali secara berulang yang bertujuan untuk memperoleh DNA yang memiliki tingkat kemurnian tinggi. Supernatan yang telah terpisah dari fase organik, ditambahkan isoproponal dingin sebanyak 500 µl dan NaCl atau NaOAc sebanyak 500 µl dan 300 µl. Campuran ini disimpan dalam freezer selama 45 menit – 1 jam. Hasil pengendapan tersebut disentrifuge pada kecepatan 13000 rpm selama 2 menit kemudian cairan dalam tabung mikro dibuang. Hasil pengendapan akan berupa pelet DNA. Pelet DNA ini kemudian ditambahkan etanol 100 sebanyak 300 µl dan disentrifuge selama 2 menit pada kecepatan 13000 rpm, kemudian cairan etanol tersebut dibuang. Setelah itu pelet DNA yang tersisa dalam tabung mikro dikeringkan dalam desikator dengan posisi terbalik selama 10 menit lalu ditambahkan larutan TE sebanyak 20 µl difortex kemudian disimpan didalam freezer. Selama proses pengeringan pelet DNA, disiapkan agarose 1 0.33 gram agarose dalam 33 ml TAE. Untuk proses elektroforesis, diambil 3 µl DNA ditambahkan 2 µl blue juice 10 X dan kemudian di running pada tegangan 100 selama ± 30 menit. DNA akan bergerak kearah positif anoda. Hasil elektroforesis kemudian direndam dalam larutan etidium Bromide ETBR 10 µl per 200 ml aquades selama 3 – 5 menit dan selanjutnya dilihat pada UV transiluminator.

3. Seleksi Primer