Bunuh Minimum KBM. Berikut ini tahapan yang dilakukan dalam penelitian:
1. Tahap Persiapan
Pada tahap ini peneliti mendata alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian. Sampel bawang lanang dibeli di Pasar Beringharjo
Yogyakarta sesuai dengan kebutuhan dalam penelitian. Populasi mikroorganisme uji yang didapatkan dari Laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada dilakukan kultur ulang terlebih dahulu untuk memperbanyak populasi mikroorganisme uji. Langkah kerja
yang dilakukan ialah dengan menyiapkan terlebih dahulu media NA miring
di tabung
reaksi lalu
menggoreskan secara
zig-zag mikroorganisme uji lalu dinkubasi selama 24 jam.
2. Tahap Pelaksanaan
a. Pembuatan Ekstrak Bawang Lanang A. sativum L.
Bawang lanang yang telah dibeli dari Pasar Beringharjo terlebih dahulu dikupas bagian kulitnya lalu dicuci bersih di bawah air
mengalir hingga benar-benar bersih. Bawang yang baik ialah dilihat dari warnanya yang putih bersih mengkilat tanpa adanya noda-noda
hitam pada bawang. Selanjutnya bawang tersebut ditimbang sebanyak 100 gram. Bawang yang telah ditimbang selanjutnya disterilkan secara
kimia. Sterilisasi dilakukan dengan melarutkan 10 ml Natrium hipoklorit dalam 3 liter akuades. Bawang tersebut direndam selama 15
menit lalu dibilas dengan menggunakan akuades steril. Ekstrak diperoleh dengan cara mengambil bawang yang telah
disterilisasi tadi, lalu dimasukkan dalam blender serta menambah 100 ml pelarut etanol konsentrasi 99.9. Proses blender harus cukup lama
agar bawang tersebut benar-benar hancur secara sempurna. Kemudian, bubur bawang disaring sebanyak 3 kali penyaringan. Pertama, disaring
menggunakan alat saring biasa dengan tujuan untuk mengeluarkan ampas-ampas bubur bawang. Kedua, hasil saringan pertama disaring
menggunakan kain saring agar bubur halus yang masih bercampur dengan ekstrak bawang keluar. Ketiga, disaring menggunakan kertas
saring hingga didapatkan ekstrak bawang lanang A. sativum L. 100.
Setelah didapatkan ekstrak dengan konsentrasi 100, ekstrak diencerkan lagi untuk mendapatkan ekstrak dengan konsentrasi 15,
30, 45, 60, 75 dan 90 dengan menambahkan pelarut etanol. Hasil pengenceran ekstrak dapat digunakan dalam uji aktivitas
antibakteri. Berbagai konsentrasi ekstrak pada tiap perlakuan dapat dilihat pada gambar berikut:
Gambar 3.1.Perlakuan dengan konsentrasi ekstrak bawang lanang Allium
sativum L. 15, 30, 45, 60, 75, dan 90 dengan masing perlakuan terdapat 3 kali pengulangan pada tiap cawan petri
terhadap bakteri uji yaitu bakteri gram positif S. aureus
Gambar 3.2. Perlakuan dengan konsentrasi ekstrak bawang lanang Allium
sativum L. 15, 30, 45, 60, 75, dan 90 dengan masing
15 15 15
30 30 30
45 45 45
60 60 60
75 75 75
90 90 90
15 15 15
30 30 30
45 45 45
60 60 60
75 75 75
90 90 90
perlakuan terdapat 3 kali pengulangan pada tiap cawan petri terhadap bakteri uji yaitu bakteri gram negatif E. coli.
b. Pembuatan Media Uji Nutrient Agar NA NA sebanyak 10 gram dilarutkan ke dalam 500 ml akuades lalu
dipanaskan dan dihomogenkan dengan menggunakan alat pemanas dan magnetik stirer. Media NA harus benar-benar homogen terlihat dari
warna kuning bening yang menunjukkan bahwa NA telah bercampur secara baik dengan akuades. NA sebanyak 50 ml dipisahkan untuk
membuat agar miring pada tabung reaksi dengan masing-masing tabung berisi 10 ml NA yang akan digunakan untuk perbanyakan
bakteri mikroorganisme uji. Sisanya dimasukkan dalam erlenmeyer sebagai stok untuk membuat media NA di cawan petri yang akan
digunakan sebagai media tumbuhnya bakteri.
c. Sterilisasi Alat dan Media
Alat dan bahan yang akan digunakan dalam penelitian disterilisasi untuk menghindari terjadinya kontaminasi dalam
praktikum. Pertama, alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian didetoks terlebih lalu dikeringkan. Selanjutnya alat yang telah didetoks
bersama dengan bahan media disterilisasi dalam autoklaf dengan tekanan 121°C selama 15 menit. Alat-alat yang disterilkan dengan
menggunakan autoklaf ialah alat yang biasanya terbuat dari kaca seperti tabung reaksi, cawan petri, erlenmeyer. Alat lainnya seperti pinset,
kaca benda cukup dengan dipijarkan di atas bunsen. Sedangkan batang bengkok di celupkan kedalam alkohol sehingga saat akan digunakan
cukup dilewatkan diatas bunsen.
d. Penyiapan Mikroorganisme Uji Mikroorganisme uji yang akan digunakan dalam penelitian
disiapkan dalam tabung reaksi dan cawan petri. Pertama, untuk tabung reaksi disiapkan mikroorganime untuk memperbanyak populasi
mikroorganisme. Diambil kultur murni bakteri S. aureus dan E. coli secara aseptis menggunakan jarum ose lalu digoreskan secara zig-zag
dalam agar miring NA lalu diinkubasi selama 24 jam. Mikroorganisme uji yang akan digunakan dalam uji aktivitas
antibakteri dilakukan pengenceran bertingkat terlebih dahulu yang bertujuan untuk mengurangi jumlah populasi bakteri. Satu ose bakteri
diambil dari tabung reaksi yang berisi bakteri lalu kultur murni tersebut dimasukkan dalam tabung reaksi lain yang telah berisi 10 ml
akuades steril. Selanjutnya, suspensi bakteri tersebut dihomogenkan dengan menggunakan vortex kurang lebih selama 1 menit hingga
suspensi bakteri tersebut hingga benar-benar homogen. Untuk pengenceran selanjutnya diambil 1 ml suspensi bakteri dari tabung
reaksi awal dan ditambahkan akuades steril 9 ml dan demikian seterusnya hingga pengenceran mencapai hingga pengenceran kelima
10
-
5
. Kemudian diambil 0,1 ml suspensi bakteri dengan menggunakan pipet volume dan diletakkan suspensi bakteri tersebut di
atas media agar NA padat dalam cawan petri. Dengan menggunakan batang bengkok trigalski disapukan atau diratakan suspensi bakteri
secara merata di atas media.
e. Uji Kemurnian Mikroorganisme Uji
Mikroorganisme uji yang digunakan dalam penelitian ini ialah bakteri S. aureus dan E. coli. Uji kemurnian mikroorganisme tersebut
dengan beberapa cara yaitu: 1
Pengamatan morfologi koloni Koloni bakteri diamati dari hasil teknik streak plate. Streak
plate ialah cara untuk menginokulasi bakteri dengan cara digoreskan pada kuadran yang telah dibuat. Kuadran yang
digunakan ialah 4 kuadran dan diharapkan pada kuadran 4 akan didapatkan koloni bakteri terpisah sehingga bisa diamati bentuk dan
warna dari koloni bakteri tersebut. Empat kuadran yang digunakan dalam penelitian seperti pada gambar di bawah ini:
2 Pengamatan Morfologi Sel
Mikroorganisme uji yang akan diamati morfologi selnya dilakukan dengan metode pengecatan negatif. Langkah kerja dalam
pengecatan negatif ialah kaca benda terlebih dahulu dibersihkan dengan menggunakan alkohol lalu dikeringanginkan. Selanjutnya
mengambil satu ose koloni bakteri dan diletakkan di atas permukaan kaca benda lalu ditetesi dengan tinta cina dan
dihomogenkan dengan menggunakan tusuk gigi. Selanjutnya setelah bakteri dan tinta cina telah homogen, diambil kaca benda
lainnya yang terlebih dahulu juga telah dibersihkan dengan alkohol. Kaca benda tersebut diletakkan di ujung kaca benda yang ada
bakterinya hingga membentuk sudut 45° lalu ditarik hingga bakterinya rata dan tipis. Pengamatan dilakukan di bawah
I II
III IV
mikroskop hingga perbesaran 100 x 10 dengan menambahkan minyak emersi secukupnya agar sel bakteri bisa terlihat lebih jelas.
3 Pengecatan Gram
Langkah kerja dalam pengecatan gram ialah awalnya bersihkan kaca benda menggunakan alkohol lalu dikeringanginkan. Kemudian
letakkan satu ose koloni bakteri di atas permukaan kaca benda dan difiksasi dengan menambahkan larutan akuades steril. Fiksasi
dilakukan di atas bunsen hingga kering. Tujuan fiksasi ialah agar koloni bakteri dapat menempel pada kaca benda sehingga pada saat
dicuci bakteri tidak hanyut bersama air. Setelah kering bakteri tersebut, ditetesi dengan larutan kristal violet secukupnya hingga
menutupi bagian bakteri selama 60 detik. Setelah 60 detik, dicuci di bawah air mengalir lalu diberi iodin yang berfungsi untuk mengikat
warna dasar ungu pada bakteri selama 60 detik. Selanjutnya ditetesi alkohol yang berfungsi untuk dekolorisasi dan terakhir memberikan
safranin yang berfungsi memberi warna merah. Di antara bermacam-macam bakteri yang dicat, ada yang dapat
menahan zat warna ungu kristal violet dalam tubuhnya meskipun telah didekolorisasi dengan alkohol. Dengan demikian tubuh
bakteri itu tetap berwarna ungu meskipun disertai dengan pengecatan oleh zat warna kontras, warna ungu itu tetap
dipertahankan. Bakteri yang memberi reaksi semacam ini dinamakan bakteri gram positif. Sebaliknya, bakteri yang tidak
dapat menahan zat warna setelah dekolorisasi dengan alkohol akan kembali menjadi tidak berwarna dan bila diberikan pengecatan
dengan zat warna safranin akan berwarna sesuai warna safranin yaitu warna merah dan disebut bakteri gram negatif Irianto, 2006.
3. Tahap Perlakuan
Kategori