Parameter dalam KCKT Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT

14 dalam sampel serta sifat dari analit tersebut. Waktu retensi merupakan parameter yang mudah diukur. Waktu retensi tergantung dari laju alir fase gerak dan dimensi kolom, dimana semakin cepat laju alir yang digunakan makan semakin kecil singkat waktu retensinya. Selain itu, waktu retensi tergantung dari kestabilan laju alir. b. Faktor kapasitas Faktor kapasitas merupakan parameter penting yang dapat digunakan untuk menjelaskan laju migrasi analit dalam kolom. Untuk spesi A, faktor kapasitas k‟A didefinisikan sebagai berikut : Faktor kapasitas, k‟ = t t t R  ………………. Persamaan II.1 Jika k‟ bernilai 0 nol berarti bahwa komponen atau analit tidak diretensi dan dielusi bersama dengan pelarut. Jika k‟ bernilai satu artinya komponen diretensi secara lemah oleh fase diam dalam kolom, sementara jika k‟ bernilai duapuluh artinya komponen diretensi secara kuat dan berinteraksi dengan fase diam cukup lama. Pada sebagian besar analisis, nilai k‟ untuk analit yang terelusi berkisar antara 1 sampai 20, sehingga mempunyai peluang yang cukup untuk berinteraksi dengan fase diam menghasilkan pemisahan yang baik Ahuja dan Dong, 2005. t R adalah waktu retensi, dan t adalah waktu yang tidak teretensi. Beberapa pustaka merekomendasikan faktor kapasitas yang baik adalah 1 k‟10. c. Faktor selektivitas Faktor selektivitas adalah kemampuan sistem kromatografi untuk membedakan analit. Pemisahan antara dua komponen hanya mungkin terjadi jika keduanya mempunyai kecepatan migrasi yang berbeda saat melewati kolom Ahuja dan Dong, 2005. Faktor selektivitas α dari suatu kolom untuk spesi A dan B dinyatakan sebagai berikut : 15 M gA M gB A B A B t t t t k k K K       ………………. Persamaan II.2 dimana K B adalah koefisien partisi spesi B yang lebih kuat diretensi oleh kolom dan K A adalah koefisien partisi spesi A yang lemah diretensi kolom. Besarnya α harus 1 untuk pemisahan yang baik. Selektifitas tergantung dari komposisi fase diam dan fase gerak yang bisa ditingkatkan besarnya dengan melakukan modifikasi antara keduanya Ahuja dan Dong, 2005. d. Efisiensi kolom Jumlah lempeng teoritik N merupakan ukuran kuantitatif dari efisiensi kolom dan besarnya merupakan perbandingan antara waktu retensi t R dengan standar deviasi lebar puncak σ, sedangkan besarnya W b setara dengan 4σ yang dapat dihitung secara empiris dari kromatogram dengan rumus berikut ini : 2 2 16             b R R W t t N  ………………. Persamaan II.3 Kolom yang efisien dapat mencegah pelebaran pita sehingga menghasikan pita yang sangat sempit. Semakin kecil dan seragam ukuran partikel dalam kolom maka semakin besar efisiensinya Ahuja dan Dong, 2005. e. Resolusi Tujuan akhir dari setiap analisis menggunakan KCKT yakni pemisahan satu atau lebih analit dari komponen lain matriks dalam sampel agar didapatkan informasi yang kuantitatif dari masing-masing analit. Resolusi dari suatu kolom adalah kemampuan kolom untuk memisahkan dua analit. Resolusi dinyatakan dengan rumus sebagai berikut :     b R b b R s W t W W t t R R      2 2 1 2 1 ………………. Persamaan II.4 16 Dimana t R1 dan t R2 adalah waktu retensi spesi 1 dan 2, sedangkan W b1 dan W b2 adalah lebar alas puncak spesi 1 dan 2. Nilai R s 1,5 menunjukkan puncak 1 dan 2 terpisah dengan sempurna Ahuja dan Dong, 2005.

II.6 Pengembangan Metode Analisis

Hal-hal yang perlu di pertimbangkan sebagai tahapan dalam pengembangan metode analisis secara KCKT meliputi Kazakevich dan Lobrutto, 2007 : 1. Karakterisasi dan pengumpulan informasi analitik Mencakup pengumpulan informasi analitik analit maupun sampel termasuk matriksnya, sifat fisikokimia sampel, metode analisis yang telah ada, metode baku, perlakuan awal atau pemisahan sebelum dilakukan analisis, informasi mengenai formula dan komposisi sampel serta matriks yang digunakan dan persyaratan spesifik yang telah ditentukan. 2. Penilaian kebutuhan metode Penilaian kebutuhan metode tergantung pada tujuan analisis yang dilakukan dengan kriteria yang harus ditentukan sebelum percobaan dimulai diantaranya kecermatan, keseksamaan, kepekaan, selektivitas, linearitas dan batas deteksi. Faktor yang perlu dipertimbangkan meliputi waktu, jumlah sampel, biaya dan tenaga, kemudahan dan kepraktisan metode serta ketersediaan instrumen. 3. Penelusuran pustaka Penelusuran pustaka yang berhubungan dengan analisis dan metode analisis yang sesuai. 4. Pemilihan metode analisis Terlebih dahulu mengkategorikan golongan masalah analitik. Jika memungkinkan, metode analisis sebelumnya bisa diadopsi sehingga lebih efisien, atau dengan memodifikasi metode analisis yang sudah ada. Adaptasi dapat mencakup kondisi preparasi maupun kondisi instrumentasi. Akan tetapi jika masalah analitiknya sama sekali baru, maka perlu dibuat metode prosedur baru dengan pendekatan senyawa analog yang mempunyai kemiripan sifat fisikokimia. 5. Penyiapan alat dan studi pendahuluan 17 Menyiapkan instrumen yang sudah terkalibrasi sesuai dengan prosedur operasional baku alat. Uji pendahuluan biasanya memakan waktu yang cukup lama sebelum kondisi optimum didapatkan. 6. Optimasi Prosedur Analisis Bertujuan untuk mencari aras-aras yang optimum jika hasil studi pendahuluan jauh dari yang diharapkan, dilakukan dengan cara mengubah parameter- parameter yang mempengaruhi analisis sampai diperoleh kondisi yang paling baik. 7. Evaluasi data hasil optimasi 8. Validasi metode Validasi metode mengacu pada parameter-parameter validasi pada pustaka. Validasi diawali dengan melakukan uji kesesuaian sistem untuk memastikan bahwa sistem analisis berjalan secara baik dan benar.

II.7 Uji Kesesuaian Sistem

Uji kesesuaian sistem merupakan serangkaian uji untuk memastikan efektivitas sistem pemisahan yang digunakan. Parameter-parameter yang digunakan meliputi bilangan lempeng teoritis N 2000, faktor ikutan ≤ 2,0 , kapasitas k‟ atau α 2,0, resolusi Rs 1,5 dan nilai simpangan baku relatif SBR 2,0 dari waktu retensi dan luas area dari 5 kali injeksi Elmer dan Miller, 2004.

II.8 Validasi Metode Analisis

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Parameter analisis yang ditentukan pada validasi adalah spesifikasi, linieritas dan rentang kadar, akurasi, presisi, limit deteksi dan limit kuantisasi ICH, 1994.

II.8.1 Kekhasan Spesifisitas

Kekhasan atau spesifisitas suatu metode adalah kemampuan untuk menguji secara tegas analit yang dimaksud dengan adanya komponen lain atau yang diperkirakan ada seperti cemaran, hasil degradasi dan komponen matriks. Jika spesifisitas