mL alkohol, kemudian campuran dikocok. Hasil uji positif sampel mengandung flavonoid, yaitu terbentuknya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil
alkohol.
4 Saponin
Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N menunjukkan
sampel mengandung saponin.
5 Fenol Hidrokuinon
Sampel sebanyak 1 g diekstrak dengan 20 mL etanol 70. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 mL kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl
3
5. Hasil uji positif sampel mengandung senyawa fenol, yaitu terbentukya larutan berwarna hijau atau hijau biru.
6 Ninhidrin
Larutan sampel sebanyak 2 mL ditambahkan beberapa tetes larutan ninhidrin 0,1. Campuran dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Hasil
uji positif sampel mengandung asam amino, yaitu terbentuknya larutan berwarna biru.
3.3.4 Uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
Ekstrak kasar bintang laut dari hasil ekstraksi bertingkat menggunakan pelarut heksana, etil asetat, dan metanol, dilarutkan dalam metanol p.a dengan
konsentrasi 200, 400, 600 dan 800 ppm. Antioksidan pembanding yang digunakan yaitu antioksidan sintetik BHT dan antioksidan alami berupa α-tokoferol,
β-karoten, dan asam askorbat dan kontrol positif, dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut metanol p.a. dengan konsentrasi 2, 4, 6, dan 8 ppm. Larutan DPPH
yang digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 1 mM. Proses pembuatan larutan DPPH 1 mM dilakukan
dalam kondisi suhu rendah dan terlindung dari cahaya matahari. Larutan ekstrak dan larutan antioksidan pembanding yang telah dibuat
dengan masing-masing tiga kali ulangan, diambil 4,5 mL dan direaksikan dengan 500 µL 0,5 mL larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi yang berbeda dan telah
diberi label. Campuran tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 30
menit dan diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 517 nm. Absorbansi dari larutan blanko juga diukur untuk
melakukan perhitungan persen inhibisi. Larutan blanko dibuat dengan
mereaksikan 4,5 mL pelarut metanol dengan 500 µ L 0,5 mL larutan DPPH 1 mM dalam tabung reaksi. Larutan blanko ini dibuat hanya satu kali ulangan saja.
Proses pengenceran konsentrasi ekstrak ini ditunjukkan pada Gambar 5.
Gambar 5 Diagram alir uji aktivitas antioksidan bintang laut Culcita sp. Diagram alir pada Gambar 4 berlaku untuk setiap ekstrak kasar bintang
laut dengan pelarut heksana, etil asetat, dan metanol. Pengujian kualitatif dari metode DPPH yaitu dengan melihat warna larutan sampel ketika dicampurkan
dengan DPPH. Adanya perubahan warna ungu pada DPPH menjadi ungu yang lebih muda atau adanya warna kuning ketika pencampuran dilakukan yang
menandakan terdapatnya aktivitas antioksidan pada larutan sampel bintang laut tersebut. Proses pengenceran konsentrasi pembanding ini ditunjukkan pada
Gambar 6. Ekstrak 0,04 g
Pembuatan larutan induk dengan penambahan metanol 50 mL Pengenceran dengan metanol
200 ppm 5 mL
600 ppm 15 mL
400 ppm 10 mL
800 ppm 20 mL
Larutan sampel 4,5 mL dicampurkan dengan larutan DPPH 0,5 mL Inkubasi 30 menit pada suhu 37
o
C Ukur absorbansi dengan Spektrofotometri UV-VIS panjang gelombang 517 nm
Gambar 6 Diagram alir uji aktivitas antioksidan pembanding Pengujian kuantitatif metode DPPH dilakukan dengan cara menghitung
nilai persen inhibisi dan dilanjutkan dengan perhitungan nilai IC
50
. Setelah itu, aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel dan antioksidan pembanding
BHT, asam askorbat, ά-tokoferol, β-karoten dinyatakan dengan persen inhibisi IC
50
. Nilai konsentrasi sampel ekstrak ataupun antioksidan pembanding dan
persen inhibisinya diplot masing-masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan
y = a + bx, digunakan untuk mencari nilai IC
50
inhibitory concentration 50 dari masing-masing sampel dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x
yang akan diperoleh sebagai IC
50
. Nilai IC
50
menyatakan besarnya konsentrasi larutan sampel ekstrak ataupun antioksidan pembanding yang dibutuhkan untuk
mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50. Pembuatan larutan induk dengan penambahan metanol 50 mL
Pengenceran dengan metanol
2 ppm 5 mL
6 ppm 15 mL
4 ppm 10 mL
8 ppm 20 mL
Larutan sampel 4,5 mL dicampurkan dengan larutan DPPH 0,5 mL Inkubasi 30 menit pada suhu 37
o
C Ukur absorbansi dengan Spektrofotometri UV-VIS panjang gelombang 517 nm
BHT, asam asrkorbat, α- tokoferol, β-karoten 0,0004 g
3.3.5 Kromatografi Lapis Tipis KLT dan Bioautografi
