27
dosis 20 gekorhari. Pakan standar adalah CP 551 berupa pelet produksi PT. Charoen Pokphan.
vi. Kondisi psikologis, Kondisi psikologis tikus dapat dipengaruhi
oleh perlakuan yang berulang kali. Keadaan stres memacu produksi hormon epinefrin, norepinefrin, kortikotropin dan glukokortikoid
yang akan meningkatkan tekanan darah Guyton dan Hall, 2007. Pengaruh ini dapat dikurangi dengan adanyawaktu adaptasi
sebelum percobaan dan pemisahan subyek penelitian dalam kandang yang terpisah.
vii. Variabel terkendali, yaitu jenis kelamin, umur, berat badan,
makanan, lingkungan.
3.6. Definisi Operasional
a. Inflamasi akut Tikus jantan strain wistar jantan merupakan proses infamasi
yang dilihat melalui jumlah dan hitung jenis leukosit yang diperiksa dari darah ekor tikus
b. Ekstraksi dau pepaya adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat
larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak larut dengan pelarut cair. c.
Ekstrak adalah sediaan kering, kental atau cair dibuat dengan menyari simplisia nabati atau hewani menurut cara yang cocok diluar pengaruh cahaya
matahari langsung. d.
Maserasi adalah proses pengekstraksian simplisia menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengadukan dengan temperatur ruangan.
Universitas Sumatera Utara
28
3.7. Etika Penggunaan Binatang Percobaan
Penggunaan dan penanganan hewan di laboratorium penelitian dilakukan sesuai dengan aturan etika penelitian hewan coba yang diatur dalam Deklarasi
Helsinki untuk memperoleh “Ethical clearance” dari komite etik dan komite
ilmiah penelitian FMIPA Biologi USU Medan.
3.8. Alat dan Bahan Penelitian 3.8.1 Alat
Alat-alat yang digunakan adalah pipet tetes, timbangan, tabung uji vial, wadah bening, aerator, lampu, alat-alat gelas laboratorium seperti beaker glass, labu
takar, erlenmeyer dan sebagainya, blender Nowake, neraca listrik Chyo JP 2- 6000, neraca hewan Presica Geniwigher, GW-1500, alat PK-air Azeotropi,
KLT, rotary evaporator Buchi R-114, freeze dryer Modulyo, Edwars, serial no: 3985, cawan porselen, mortar dan stamfer, oral sonde tikus, spuit ukuran 1 ml
dan 3 ml, corong pisah, kandang tikus, Stop watch, pipet Leukosit, kamar hitung Improve Neubaeur, Objek glass kaca objek dan deck glass, mikroskop cahaya
3.8.2 Bahan
Bahan yang digunakan daun pepaya, metanol, n-heksana, air suling, karagenan, indomethacin, besi III klorida, toluene, asam klorida p, natrium
hidroksida, timbal II asetat, asam asetat anhidrat, asam sulfat p, merkuri II klorida, kalium iodida, iodium,
α-naftol, asam nitrat, bismuth nitrat, darah EDTA, Larutan Turk untuk hitung jumlah leukosit, larutan Giemsa untuk pembuatan
Universitas Sumatera Utara
29
hapusan darah yang berguna untuk pemeriksaan hitung jenis leukosit, minyak imersi
3.9. Rancangan Percobaan 3.9.1. Pembuatan Larutan Pereaksi
Pembuatan larutan pereaksi menurut Materia Medika Indonesia jilid V.
3.9.1.1. Asam klorida 2 N
Sebanyak 20 ml HClp diencerkan dengan air suling sampai 100 ml.
3.9.1.2. Besi III klorida 10 bv
Sebanyak 10 g FeCl
3
dilarutkan dalam air suling sampai 100 ml.
3.9.1.3.Natrium hidroksida Sebanyak 8 gram kristal NaOH dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml
3.9.1.4.Timbal II asetat
Sebanyak 15,17gram kristal timbal II asetat dilarutkan dalam air suling hingga 100 ml
3.9.1.5.Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 gram kalium iodide dilarutkan dalam 20 ml air suling kemudian ditambahkan 2 gram iodium sambil diaduk sampai larut, lalu ditambahkan
air suling hingga 100 ml.
3.9.1.6.Pereaksi Dragendorff
Sebanyak 8 gram bismuth nitrat dilarutkan dalam asam nitrat 20 ml kemudian dicampur dengan larutan kalium iodida sebanyak 27,2 gram dalam 50
ml air suling. Campuran didiamkan sampai memisah sempurna. Larutan jernih diambil dan diencerkan dengan air suling secukupnya hingga 100 ml.
Universitas Sumatera Utara
30
3.9.1.7.Pereaksi Mayer
Sebanyak 5 gram kalium iodida dilarutkan dalam 10 ml air suling kemudian ditambahkan larutan 1,36 gram merkuri II klorida dalam 60 ml air suling.
Larutan dikocok dan ditambahkan air suling hingga 100 ml.
3.9.1.8.Pereaksi Molish
Sebanyak 3 gram α-naftol dilarutkan dalam asam nitrat 0,5N secukupnya hingga 100 ml.
3.9.2. Penyiapan Bahan
Penyiapan bahan meliputi determinasi tumbuhan, pengumpulan bahan dan pembuatan simplisia.
3.9.2.1.Determinasi Tumbuhan
Determinasi tumbuhan dilakukan oleh Laboratorium Taksonomi Tumbuhan FMIPA USU.
3.9.2.2.Pengumpulan Bahan
Sampel yang digunakan adalah daun pepaya yang biasa dikonsumsi oleh masyarakat sebagai bahan baku sayuran. Sampel diambil dari kebun pepaya di
Medan. Pengambilan
sampel dilakukan
secara purposif
yaitu tanpa
membandingkan dengan tempat tumbuh di daerah lain.
3.9.3 Pembuatan Simplisia
Daun pepaya dibersihkan dari kotoran, dicuci dengan air bersih, ditiriskan. Daun dikering anginkan tanpa terkena cahaya matahari. Simplisia yang diperoleh
diserbuk dengan blender dan disimpan dalam wadah yang sesuai.
Universitas Sumatera Utara
31
3.9.3.1. Pemeriksaan Pendahuluan Kandungan Kimia Serbuk Simplisia
Dilakukan pemeriksaan golongan alkaloid, flavonoid, glikosida, saponin, tannin, steroid.
3.9.3.1.1. Pemeriksaan alkaloid
Sebanyak 500 mg serbuk simplisia ditambahkan 1 ml HCl 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2 menit, didinginkan dan disaring.
Filtrat dipakai untuk percobaan berikut: a.
Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning.
b. Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat, akan
terbentuk endapan berwarna coklat sampai hitam. c.
Filtrat sebanyak 3 tetes ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff, akan terbentuk endapan berwarna merah atau jingga.
Alkaloid positif jika terjadi endapan atau kekeruhan paling sedikit dengan 2 atau 3 percobaan diatas.
3.9.3.1.2. Pemeriksaan Glikosida
Sebanyak 3 gram serbuk simplisia disari dengan 30 ml etanol 95 dan air suling 7:3 dan 10 ml asam sulfat 2 N, lalu direfluks selama 1 jam. Didinginkan
dan disaring. Pada 20 ml filtrat ditambah dan didiamkan selama 5 menit, disaring. Filtrat disari tiga kali, tiap kali dengan 20 ml campuran 3 bagian kloroform dan 2
bagian isopropanol. Kumpulan sari air diuapkan pada suhu tidak lebih dari 50 C.
Sisa dilarutkan dengan 2 ml metanol. Larutan sisa dimasukkan ke tabung reaksi, selanjutnya diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5
Universitas Sumatera Utara
32
tetes larutan pereaksi Molish. Ditambahkan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung, akan terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan
menunjukkan adanya glikosida.
3.9.3.1.3. Pemeriksaan Saponin
Sebanyak 0,5 gram serbuk dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air panas, kemudian dikocok selama 10 detik, jika terbentuk busa setinggi 1
cm sampai 10 cm yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N, menunjukkan adanya saponin.
3.9.3.1.4. Pemeriksaan Flavonoid
Sebanyak 0,5 g serbuk direfluks dengan 10 ml metanol selama 10 menit, kemudian disaring. Filtratnya diencerkan dengan 10 ml air suling. Setelah dingin
ditambahkan 5 ml eter minyak tanah, dikocok hati-hati, dan didiamkan. Lapisan metanol diambil, lalu diuapkan pada suhu 40
C, sisanya dilarutkan dalam 1 ml etanol, kemudian ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 10 ml asam klorida
pekat, jika terjadi warna merah jingga sampai merah ungu menunjukkan adanya flavonoida.
3.9.3.1.5. Pemeriksaan Tanin
Sebanyak 500 mg sampel disari dengan 10 ml air, disaring, lalu diencerkan sampai hampir tidak berwarna. Kepada 2 ml larutan sampel ditambahkan 1-2 tetes
larutan FeCl
3
10 dan diperhatikan warna yang terjadi, warna biru, biru-hitam, hijau atau biru-hijau dan endapan menunjukkan adanya tanin.
3.9.3.1.6. Pemeriksaan Steroida
Sejumlah 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam, disaring. Filtrat digunakan untuk reaksi berikut: 5 ml larutan eter diuapkan di
Universitas Sumatera Utara
33
dalam cawan penguap, ke dalam sisa ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfatp. reaksi steroida positif bila terjadi warna merah-ungu atau
biru-hijau.
3.9.4. Pembuatan Ekstrak Metanol dan n-Heksana 3.9.4.1. Pembuatan Ekstrak Metanol Daun Pepaya
Sebanyak 1000 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana bertutup dan dibasahi dengan sejumlah cairan penyari metanol, dimaserasi selama
48 jam. Cairan disaring hingga diperoleh cairan berwarna, diulangi hingga tiga kali. Maserat dirotavapor hingga menjadi ekstrak agak pekat, selanjutnya metanol
diuapkan hingga tidak bersisa. Hasil akhir berupa ekstrak pekat. Untuk penggunaan pada hewan coba, ekstrak pekat dikeringkan hingga membentuk
serbuk.
3.9.4.2. Pembuatan Ekstrak n-Heksana Daun Pepaya
Sebanyak 1000 gram serbuk simplisia dimasukkan ke dalam bejana bertutup dan dibasahi dengan sejumlah cairan penyari n-heksana, dimaserasi
selama 48 jam. Cairan disaring hingga diperoleh cairan berwarna, diulangi hingga tiga kali. Maserat dirotavapor hingga menjadi ekstrak agak pekat, selanjutnya n-
heksana diuapkan hingga tidak bersisa. Hasil akhir berupa ekstrak pekat. Untuk penggunaan pada hewan coba, ekstrak pekat dikeringkan hingga membentuk
serbuk.
Universitas Sumatera Utara
34
Diuapkan metanoln-heksana dengan penangas air
3.9.5. Penyiapan Bahan Uji, Kontrol, dan Obat Pembanding
Ekstrak metanol dan n-heksana daun pepaya dibuat dalam bentuk suspensi menggunakan CMC 1 . Obat pembanding indomethacin dibuat dalam bentuk
suspensi menggunakan CMC 1 dengan dosis 5 mgkg BB. Kontrol yang digunakan adalah suspensi CMC 1 dalam air suling.
3.9.6. Penyiapan Induktor Radang
Dibuat karagenan 1 dalam air suling kemudian diaktifkan dengan cara menginkubasinya pada suhu 37
C selama 24 jam. 1000 gram daun pepaya
Ekstrak metanol n-heksana
Ekstrak metanol n-heksana sedikit pekat Residu
Dicuci, dikeringkan, diserbuk Dimaserasi dengan metanol n-heksana selama 48 jam diulangi 3x
Diskrining fitokimia Dirotavapor
Gambar 3.1. Diagram proses pembuatan ekstrak metanol dan n-heksana daun pepaya Ekstrak pekat metanol n-heksana
Universitas Sumatera Utara
35
3.9.7. Persiapan Hewan Coba
Dua minggu sebelum pengujian, hewan percobaan dipelihara pada kandang yang mempunyai ventilasi yang baik dan selalu dijaga kebersihannya. Hewan
yang sehat ditandai dengan kenaikan berat badan yang teratur dan memperlihatkan gerakan yang lincah.
3.9.8. Prosedur Pengujian Antiinflamasi 3.9.8.1. Penelitian inflamasi akut
Pada hari pengujian, masing-masing hewan ditimbang. Sebelum perlakuan, diambil darah dari pangkal ekor tikus, kenudian dilakukan pemeriksaan
jumlah leukosit dengan alat Haemocytometer dan pemeriksaan hitung jenis leukosit. Kemudian pada masing-masing kelompok P0-P5 diberikan perlakuan
seperti tabel di bawah ini. Tabel 3.1. Perlakuan hewan coba pada percobaan inflamasi akut
No Kelompok Perlakuan
Jumlah 1
Kelompok P0 Salin per oral
6 2
Kelompok P1 Indomethacin 10 mgkgBB per oral
6 3
Kelompok P2 Ekstrak metanol daun pepaya dosis I 250 mgkg
6 4
Kelompok P3 Ekstrak metanol daun pepaya dosis II500mgkg
6 5
Kelompok P4 Ekstrak n heksana daun pepaya dosis I250 mgkg
6 6
Kelompok P5 Ekstrak n heksana daun pepaya dosis II500mgkg
6
Satu jam kemudian masing-masing telapak kaki tikus disuntik secara intraplantar dengan metode subkutan dengan 0,1 ml larutan karagenan 1
Universitas Sumatera Utara
36
subkutan. Setelah 3 jam dan enam jam dari penyuntikan karagenan diambil lagi dari pangkal ekor tikus, kenudian dilakukan pemeriksaan jumlah leukosit dengan
alat Haemocytometer dan pemeriksaan hitung jenis leukosit. Secara skematis alur prosedur penelitian digambarkan sebagai berikut:
Gambar 3.2. Alur Prosedur Penelitian
Universitas Sumatera Utara
37
3.10. Prosedur Pemeriksaan Jumlah Leukosit
Alat yang diperlukan : a. Pipet Leukosit
b. Kamar hitung Improved Neubauer c. Deck glass
Reagensia : Larutan Turk, saring sebelum dipakai
Cara Pemeriksaan : 1.
Sampel darah kapiler atau darah EDTA Oksalat Wintrobe 2.
Pipet lekosit diisi dengan darah sampai garis 0,5 bila diduga lekopeni sampai garis 1, bersihkan ujung pipet dengan kertas tissue
3. Sambil menahan darah pada ujung pipet, isi pipet dengan larutan Turk
sampai angka 11, letakkan pipet horizontal untuk menghindari mengalirnya larutan keluar
4. Ujung pipet ditekan dengan kedua jari kemudian digoyang membuat angka
8 selama 3 sampai 5 menit 5.
Buang 3 tetes larutan tersebut, kemudian dnegan membuat sudut 30 derajat teteskan larutan ke dalam kamar hitung yang telah ditutup dengan kaca
penutup 6.
Diamkan kamar hitung selama 2 menit 7.
Hitung dibawah mikroskop dengan pembesaran 10 x bidang besar kamar. Hitung A+B+C+D
8. Perhitungan :Pengencer pipet 20 x luas bidang besar 1 mm2 dan tinggi
kamar hitung 110 mm. Lekosit yang dihitung dalam 4 bidang besar adalah
Universitas Sumatera Utara
38
A+B+C+D, jumlah luasnya 4 mm3. Faktor perkalian 50 kali Jumlah lekosit adalah A+B+C+D x 50 mm3
3.11. Prosedur pemeriksaan hitung jenis leukosit 3.11.1. Cara membuat sediaan hapus
