19
3.2.2.5 Perhitungan Sel Limfosit
Dalam penelitian ini, sel limfosit diekstrak dari organ limpa tikus. Tikus percobaan diterminasi dengan cara dislokasi cervicalis dan dibedah untuk diambil organ limpanya secara steril.
Limpa dicuci dengan menggunakan phosphate buffer saline PBS steril, selanjutnya dipindahkan ke dalam cawan petri yang berisi 5 ml RPMI-1640 steril dalam keadaan dingin. Limpa digerus sehingga
diperoleh sel limfosit. Setelah digerus, limfe dimasukkan ke dalam tabung sentrifus steril dan disentrifugasi dengan
kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, sedangkan pelet sel diberi 2 ml NH
4
Cl 0.85 steril untuk melisis sel-sel darah merah selama dua menit dan segera ditambahkan 3 ml RPMI-
1640. Suspensi sel kembali disentrifus 1750 rpm selama 10 menit. Endapan mengandung sel limfosit, sedangkan supernatan dibuang dengan menggunakan pipet Pasteur. Endapan sel limfosit dicuci
kembali dengan RPMI-1640 dan diencerkan dengan 2 ml RPMI-1640. Endapan tersebut selanjutnya dihitung jumlah sel yang hidupnya dengan bantuan pewarna tryphan blue dengan perbandingan 1:1.
Sebanyak 50 l campuran ditempatkan dalam hemasitometer. Penghitungan dilakukan dengan
perbesaran mikroskop 400 kali. Sel yang hidup tidak berwarna dan secara visual dinding selnya tampak kompak. Sedangkan sel yang mati terlihat berwarna biru karena membran sel telah rusak
sehingga dinding sel terlihat keriput. Jumlah sel yang hidup dihitung pada area dua kotak besar yang masing-masing terdiri dari 16
kotak kecil. Sel yang terhitung merupakan proliferasi limfosit mencit secara in vivo. Proliferasi sel limfosit dihitung dengan rumus:
2
3.2.2.6 Analisis Kadar MDA Hati dan Ginjal Tikus Percobaan
Prangdimutri et al. 2009
Sebanyak 1.25 g hati atau 0.25 g ginjal segar dicacah pada kondisi dingin dalam 2.5 ml larutan PBS phosphate buffer saline yang mengandung 11.5 gL KCl. Homogenat disentrifugasi dua
kali pada 4,000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 1 ml supernatan yang diperoleh ditambah 4 ml HCl dingin 0.25 N yang mengandung 15 TCA, 0.38 TBA, dan 0.5 BHT. Campuran dipanaskan
pada suhu 80ºC selama 1 jam. Setelah dingin, campuran disentrifugasi pada 3,500 rpm selama 10 menit. Absorbansi supernatan diukur pada panjang gelomba
ng 532 nm. Sebagai larutan standar digunakan TEP tetraetoksi propana. Perhitungan dan kurva standar TEP dapat dilihat pada Lampiran
1.
3.2.2.7 Analisis Aktivitas SOD Hati dan Ginjal Tikus Misra dan Fredovich 1972
Sampel hati dihancurkan dan diekstraksi dengan buffer fosfat pH 7, dengan perbandingan 1:10. Hasil ekstraksi disentrifus dengan kecepatan 3,000 rpm selama 10 menit dalam
keadaan dingin. Jumlah selml = jumlah sel yang hidup x fp x 10
4
, fp =2 2
20
Sebanyak 1 ml homogenat hati ditambahkan dengan 1.6 ml campuran kloroform dan etanol 96 dengan perbandingan 3:5. Selanjutnya homogenat hati tersebut divorteks 1 menit dan disentrifus pada
3000 rpm selama 10 menit pada 4ºC. Supernatan disimpan pada suhu -15ºC hingga siap dianalisis. Pengukuran serapan dilakukan dengan cara memasukkan
2800 l buffer natrium karbonat pH 10.2 Lampiran 2, 100 l sampel yaitu supernatan yang mengandung SOD dan 100 l larutan
epinefrin ke dalam tabung reaksi. Serapan dibaca pada panjang gelombang 480 nm pada menit ke 1, 2, 3, dan 4 setelah penambahan epinefrin 0.003 M. Sebagai faktor pengoreksi atau blanko digunakan
campuran HCl dan air bebas ion. Larutan tanpa sampel yaitu larutan yang diberi pereaksi seperti pereaksi sampel, namun
sampel diganti air bebas ion, lalu diukur absorbansinya. Pembuatan larutan tanpa sampel ini dilakukan dengan menambahkan 2,8
00 l buffer natrium karbonat konsentrasi 0.05 M dan memiliki pH 10.2 dituang pada tabung reaksi kemudian ditambahkam dengan 100 l larutan epinefrin yang memiliki
konsentrasi 0.003 M, dan 100 l air bebas ion. Serapan diukur setelah penambahan epinefrin pada panjang gelombang 480 nm.
Perhitungan aktivitas SOD dinyatakan dengan satuan unitmg protein dengan cara mengukur hambatan:
hambatan = 3
Kemudian nilai hambatan ini dikonversikan dalam kurva standar SOD di mana hambatan sumbu Y dan aktivitas SOD dalam unitmg protein sumbu X telah diketahui. Cara
pengambilan organ pada tikus percobaan diperlihatkan pada Gambar 4.
Gambar 4. Cara pengambilan organ tikus percobaan
3.2.3 Rancangan Percobaan
Kategori