41
Lampiran 1. Pereaksi-pereaksi untuk Analisis MDA dan Kurva Standar TEP 1.1. TCA 15 wv
Sebanyak 25 g TCA dilarutkan dengan air bebas ion sampai volume 100 ml.
1.2. TBA Thiobarbaturic
acid 37 wv dalam 0.25 N HCl pH 2-3
Sebanyak 0.7 g TBA dilarutkan dengan HCl 0.25 N sampai volume 100 mL.
1.3. Larutan Standar 1,1,3,3 tetraetoksipropana
Dari larutan tetraetoksipropana dibuat sederetan larutan standar dan diukur absorbansinya dan dibuat kurva standar.
Konsentrasi nmolml Absorbansi
0.0125 0.012
0.0500 0.030
0.1000 0.032
0.2000 0.076
0.4000 0.123
0.8000 0.200
Gambar 10. Kurva standar TEP untuk pengukuran MDA
42
Lampiran 2. Penentuan aktivitas SOD 2.1. Persiapan sampel
Hati tikus diekstrasi dengan PBS dengan perbandingan 1: 10. Hasil ekstrasi di sentrifuse pada 3000 rpm selama 10 menit dalam keadaan dingin menggunakan sentrifuse dingin suhu 4°C.
Supernatan homogenat disimpan pada suhu -15°C sampai saat akan diukur.
2.2. Aktivitas Enzim Superoksida Dismutase SOD
Aktivitas SOD ditentukan berdasarkan metode yang dikembangkan oleh Misra dan Fridovich 1972. Prinsip metode Misra dan Fredovich ini berdasarkan kepada kemampuan dari SOD dalam
menghambat autooksidasi epinefrin menjadai adenokrom. Satu unit aktivitas SOD adalah kemampuan dari SOD untuk menghambat 50 autooksidasi epinefrin menjadi adenokrom. Adenokrom pada
panjang gelombang 480 nm memberikan warna coklat muda yang dapat dideteksi menggunakan spektrofotometer.
2.3. Persiapan pengukuran sampel
1 ml homogenate hati atau ginjal ditambahkan dengan 1.6 ml campuran kloroform-etanol 96 3 : 5, vortex selama 1 menit kemudian disentrifus pada 3000 rpm selama sepuluh menit, pada
suhu 4°C.
2.4. Pembuatan larutan epinefrin 0.003 M
Larutan epinefrin 0.003 M dibuat dengan jalan melarutkan 5.496 mg epinefrin dengan 10 ml HCl 0.01 N simpan dalam botol bewarna, larutan ini tahan untuk beberapa hari.
2.5. Pengukuran serapan dengan alat spektrofotometer
Ke dalam kuvet tambahkan 2800 µl buffer natrium karbonat 0.05 M pH 10.2, 100 µl sampel supernatan hati atau ginjal dan 100 µl larutan epinefrin. Serapan dibaca pada panjang gelombang
480 nm dan menit ke 1, 2, 3, 4 setelah penambahan epinefrin 0.003 M. Perubahan absorban dicatat. Sebagai blanko digunakan campuran HCL dan air bebas ion.
Larutan tanpa sampel diukur dengan cara menambahkan 2800µl buffer natrium karbonat 0.05 M pH 10.2, 100 µl sampel diganti dengan 100 µl air bebas ion dan 100 µl larutan epinefrin.
2.6. Kurva standar
