BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak lengkap pola satu arah.
B. Metode Penelitian
Metode pengujian efek analgesik yang digunakan pada penelitian ini yaitu metode rangsang kimia. Pada metode ini digunakan rangsang kimia berupa
asam asetat yang diberikan secara intraperitoneal pada mencit yang sudah diberi senyawa uji secara per oral pada selang waktu tertentu. Respon nyeri pada mencit
adalah geliat berupa kontraksi perut disertai tarikan kedua kaki belakang dan perut menempel pada lantai. Geliat diamati setiap 5 menit selama 1 jam. Pemberian
analgesik akan mengurangi rasa nyeri sehingga jumlah geliat yang terjadi berkurang. Daya analgesik dapat dievaluasi menggunakan persen penghambatan
terhadap geliat, yaitu: penghambatan terhadap geliat = 100 – [PK x 100]
Keterangan: P = jumlah kumulatif geliat hewan uji setelah pemberian obat
yang telah ditetapkan K = jumlah rata-rata geliat hewn uji kelompok kontrol
Metode ini dipilih karena metode ini sederhana, mudah dilakukan, serta peka untuk pengujian senyawa-senyawa yang memiliki daya analgesik lemah
. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
C. Variabel Operasional
1. variabel
Variabel penelitian ini meliputi: a.
variabel bebas : dosis ekstrak etanol daun senggani per kg berat
badan mencit putih betina. b.
variabel tergantung : prosentase daya analgesik ekstrak etanol daun
senggani terhadap mencit putih betina. c.
variabel pengacau terkendali : 1
subyek uji : mencit betina galur Swiss
2 umur subyek
: 2-3 bulan 3
berat badan : 20-30 gram
4 keadan subyek uji
: sehat 5
asal tanaman senggani : BPTO Tawangmangu, Solo, Jawa Tengah
6 proses isolasi senyawa kimia daun senggani menggunakan penyari
etanol 70 dengan metode perkolasi dimana proses ekstraksi dihentikan sampai ekstrak yang keluar berwarna putih bening
d. variabel pengacau tak terkendali
: 1
suhu pemanasan saat proses penguapan ekstrak etanol daun senggani 2
kemampuan absorbsi mencit terhadap ekstrak etanol daun senggani
2. definisi operasional
a. dosis ekstrak etanol daun senggani
Dosis diperoleh dengan cara mencari konsentrasi maksimum ekstrak etanol daun senggani dalam CMC-Na 1 yaitu sebesar 5, sehingga
didapat dosis maksimum. Kemudian dibuat empat peringkat dosis dengan mengalikan dengan satu bilangan tertentu sehingga didapat suatu deret
ukur. b.
daya analgesik daya analgesik menunjukkan seberapa besar suatu zat tertentu dalam
memberi efek analgesik, yang ditunjukkan dengan besarnya nilai persen penghambatan terhadap respon geliat.
c. uji daya analgesik
uji daya analgesik menggunakan metode rangsang kimia yaitu suatu metode uji analgesik yang menggunakan rangsang kimia berupa zat kimia
yang diberikan secara intraperitoneal pada mencit yang sudah diberi senyawa uji secara oral pada selang waktu tertentu. Respon nyeri pada
mencit adalah geliat berupa kontraksi perut disertai tarikan kedua kaki belakang dan perut menempel pada lantai. Geliat diamati setiap 5 menit
selama 1 jam. d.
ekstrak etanol ekstrak etanol diperoleh dengan cara mengekstraksi bahan, yaitu daun
senggani, dalam pelarut etanol dengan menggunakan metode perkolasi. Sehingga didapat ekstrak etanol daun senggani.
D. Bahan Penelitian
1. Bahan
a. Hewan uji
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini berupa mencit betina, galur Swiss, berat 20-30 gram, umur 2-3 bulan, yang diperoleh dari
Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
b. Daun Senggani
Bahan uji yang digunakan berupa daun senggani Melastoma polyanthum, Bl. yang diperoleh dari Badan Penelitian Tanaman Obat, Tawangmangu,
Kabupaten Karang Anyar, Jawa Tengah pada bulan Mei 2006.
2. Bahan Kimia
a. Asetosal
: berupa hablur tidak berwarna atau serbuk hablur putih; tidak berbau atau hampir tidak berbau; rasa asam. Khasiat dan penggunaan
sebagai analgetikum, antipiretikum Anonim, 1979. Asetosal yang digunakan dalam penelitian diproduksi oleh Brataco Chemika dengan
kualitas farmasetis. b.
CMC Na : berupa serbuk halus atau berbentuk granul berwarna putih,
bersifat higroskopis Anonim, 1995, diproduksi oleh Brataco Chemika dengan kualitas farmasetis.
c. Asam asetat : berupa cairan jernih; tidak berwarna; bau khas, tajam jika
diencerkan dengan air; rasa asam Anonim, 1979, diproduksi oleh Merck
dengan kualitas teknis.
E. Alat atau Instrumen Penelitian
Peralatan yang digunakan seperti di bawah ini:
1. Alat Ekstraksi
a. Seperangkat alat gelas berupa bekker glass, erlenmeyer, gelas ukur, labu
ukur, cawan porselen, pipet tetes, batang pengaduk. b.
Perkolator c.
Waterbath d.
Neraca merek mettler Toledo
2. Alat Uji Geliat
a. kotak kaca tempat pengamatan geliat
b. stopwatch
c. jarum yang digunakan untuk pemberian per oral, berupa jarum yang
ujungnya berbentuk bulat dan berlubang di bagian tengah d.
spuit injeksi yang memiliki ujung runcing dan digunakan untuk pemberian secara intraperitoneal dengan merek Terumo
3. Lain-lain
a. neraca analitik merek Mettler Toledo
b. timbangan merek Mettler Toledo
c. pemanas merek Ika Combimag Net
F. Tata Cara Penelitian
Penelitian ini dilakukan menurut tata cara sebagai berikut:
1. Pengumpulan bahan
a. bahan uji yang digunakan yaitu daun senggani yang diperoleh dari Badan
Penelitian Tanaman Obat, Tawangmangu, Kabupaten Karanganyar, Jawa Tengah pada bulan Mei 2006.
b. Bahan kimia yang digunakan yaitu: etanol, asetosal, CMC Na, dan asam
asetat yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi, aquadest yang diproduksi oleh Laboratorium Kimia Organik, Fakultas
Farmasi, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Pembuatan ekstrak etanol daun senggani
Daun senggani yang sudah dikeringkan, diblender sampai halus. Seratus lima puluh gram serbuk daun senggani yang telah dibasahi terlebih dahulu
dengan etanol 70 dimasukkan ke dalam perkolator, kemudian direndam dengan etanol 70 sampai mencapai ketinggian 1,5 cm di atas permukaan
serbuk selama 24 jam. Kran perkolator dibuka dan kecepatan aliran diatur sehingga tiap 1 menit didapat perkolat sebanyak 20 tetes. Selama proses
perkolasi berlangsung tinggi etanol di atas permukaan serbuk harus tetap 1-1,5 cm. Perkolat ditampung dalam erlenmeyer. Ekstraksi dihentikan jika perkolat
yang keluar berwarna bening. Perkolat yang diperoleh diuapkan di atas waterbath
hingga diperoleh perkolat yang kental pekat. Ekstrak pekat kemudian disimpan di dalam lemari pendingin kulkas.
3. Pembuatan larutan CMC Na 1
Larutan CMC Na 1 dibuat dengan cara menimbang dengan seksama 250 mg serbuk CMC Na kemudian ditaburkan di atas air panas sedikit demi
sedikit hingga mengembang sambil diaduk. Setelah terbentuk larutan kemudian dimasukkan dalam labu ukur 25 mL dan ditambah aquadest hingga
25 mL lalu digojog.
4. Pembuatan suspensi asetosal 0,5 dalam CMC Na 1
Asetosal yang digunakan sebagai kontrol positif ditimbang seksama sebanyak 125 mg dan disuspensikan ke dalam suspensi CMC Na 1 volume
25 mL.
5. Pembuatan asam asetat 1
Larutan asam asetat ini dibuat dari larutan asam asetat glasial 100 vv dengan pengenceran menggunakan rumus volume
1
x konsentrasi
1
= volume
2
x konsentrasi
2
. Sebanyak 0,25 mL asam asetat 100 diencerkan dengan
aquadest hingga volume 25,0 mL menggunakan labu ukur 25 mL. 6.
Pembuatan suspensi ekstrak etanol daun senggani 4 dalam CMC Na 1
Ekstrak etanol daun senggani ditimbang seberat 400,0 mg kemudian dilarutkan dalam CMC Na 1. Setelah itu, ditambahkan larutan CMC Na 1
sampai volume 10,0 mL.
7. Penetapan kriteria geliat
Respon yang diamati pada uji daya analgesik ini berupa geliat. Kriteria geliat perlu ditetapkan untuk mendapatkan geliat yang hampir sama. Pedoman
gerakan mencit yang dianggap sebagai geliat adalah apabila mencit menarik kedua kaki belakang ke belakang dengan mengempiskan perutnya sehingga
permukaan perut menempel pada alas tempat berpijak mencit itu, yaitu alas pada kotak kaca tempat pengamatan. Respon geliat yang timbul merupakan
akibat dari pemberian asam asetat yang bersifat mengiritasi jaringan dan diberikan secara intraperitoneal. Adanya jaringan yang rusak mengakibatkan
timbulnya rasa sakit dan mencit memberikan respon geliat.
8. Penetapan kadar dan dosis asam asetat
Menurut Williamson 1996 asam asetat kadar 1-3 digunakan sebagai iritant
yang menyebabkan nyeri pada pengujian daya analgesik dengan metode geliat. Sumber lain menyebutkan bahwa asam asetat 1 sudah dapat
menimbulkan geliat yang cukup banyak selama pengamatan Putra, 2004. Penetapan dosis asam asetat menggunakan tiga peringkat dosis, yaitiu 25
mgkg BB, 50 mgkg BB, dan 100 mgkg BB. Sebanyak sembilan ekor hewan uji, mencit betina, galur Swiss, berat 20-30 gram, umur 2-3 bulan yang telah
dipuasakan ± 18-22 jam dibagi ke dalam 3 kelompok. Masing-masing kelompok terdiri dari 3 ekor mencit diinjeksi secara intraperitoneal dengan
asam asetat 1 berturut-turut dengan dosis 25 mgkg BB, 50 mgkg BB, dan 100 mgkg BB untuk tiap kelompoknya. Setelah itu diamati geliatnya selama
60 menit dan dicatat jumlah geliat tiap 5 menit. Kelompok dosis yang menunjukkan jumlah geliat paling banyak digunakan sebagai kontrol negatif,
yaitu yang memberikan jumlah geliat yang tidak terlalu sedikit dan tidak terlalu banyak akan menyulitkan pengamatan.
9. Penetapan kontrol negatif
Penetapan kontrol negatif ini bertujuan untuk mengetahui zat yang tidak memiliki daya analgesik, sehingga dapat digunakan untuk membandingkan
dengan zat uji. Kontrol negatif yang digunakan untuk pembanding yaitu aquadest dan CMC Na 1. Dua senyawa tersebut diberikan pada hewan uji
dengan menghitung volume pemberian sesuai dengan berat badan hewan uji. Jika kedua kelompok tersebut tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna
maka digunakan kelompok CMC Na untuk perhitungan daya analgesik, yang pada penelitian ini digunakan sebagai pensuspensi zat uji.
10. Penetapan selang waktu pemberian rangsang
Penetapan selang waktu pemberian rangsang bertujuan untuk mengetahui waktu zat uji memberikan efek analgesik secara optimal. Rentang
waktu yang diujikan adalah 5, 10, dan 15 menit. Sebanyak sembilan ekor hewan uji, mencit betina, galur Swiss, berat 20-30 gram, umur 2-3 bulan yang
telah dipuasakan ± 18-22 jam dibagi ke dalam 3 kelompok. Masing-masing kelompok terdiri dari 3 ekor mencit diinjeksi secara intraperitoneal dengan
asam asetat 1 menggunakan dosis efektif asam asetat yang diperoleh dari penetapan dosis asam asetat dengan selang waktu 5, 10, dan 15 menit.
11. Penetapan dosis dan kadar asetosal
Dosis asetosal yang digunakan dalam penelitian ini adalah dosis lazim 0,5 g. Jika dikonversikan pada mencit maka dosisnya dihitung sebagai berikut:
Berat badan manusia Indonesia adalah 50 kg. Faktor konversi dengan pedoman manusia Eropa 70 kg adalah 7050 kg = 0,7 g atau 700 mg. Konversi
dari manusia ke mencit adalah 0,0026 x 700 mg = 1,82 mg. Maka dosis asetosal adalah:
1000 20 x 1,82 mgkg BB yaitu 91 mgkg BB. Untuk menetapkan dosis asetosal digunakan tiga peringkat dosis yaitu 68,25 mgkg BB, 91 mgkg BB,
dan 113,75 mgkg BB. Dalam penetapan dosis asetosal digunakan 9 ekor mencit yang dibagi
dalam tiga kelompok. Masing-masing kelompok terdiri dari 3 ekor mencit, galur Swiss, berat 20-30 gram, umur 2-3 bulan yang telah dipuasakan ± 18-22
jam sebelumnya. Tiap- tiap kelompok diberi suspensi asetosal dengan tiga peringkat dosis. Kemudian mencit diinjeksi dengan asam asetat secara
intraperitoneal dengan selang waktu yang paling efektif dari penetapan waktu waktu pemberian asam asetat yaitu 10 menit dan menggunakan dosis yang
paling efektif dari penetapan dosis asam asetat yaitu 50 mgkg BB. Geliat mencit yang timbul diamati selama 60 menit dengan dicatat jumlah geliatnya
tiap 5 menit. Kelompok dosis yang paling efektif digunakan sebagai kontrol positif.
Kadar asetosal yang digunakan sebesar 0,5 dengan mengikuti penelitian terlebih dahulu yang telah melakukan orientasi menggunakan
berbagai kadar tertentu.
12. Penetapan dosis dan kadar ekstrak etanol daun senggani
Penetapan dosis dan kadar berdasarkan orientasi dimulai dari dosis 1 gkg BB Williamson et al., 1996. Kadar ekstrak etanol daun senggani
dibuat 5 agar dalam pemberiannya tidak melebihi volume pemberian PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
maksimum mencit per oral, yaitu 1 mL. Dari hasil orientasi dosis dan kadar tersebut ternyata memberikan efek analgesik sehingga dari dosis awal tersebut
kemudian ditetapkan tiga peringkat dosis dengan cara menentukan kelipatannya. Dalam penelitian ini digunakan angka kelipatan sebesar 1,26
kalinya, sehingga didapatkan 3 peringkat dosis lainnya yaitu : 1330 mgkg BB 1,26 x dosis 1000 mgkg BB, 1670 mgkg BB 1,26 x dosis 1330 mgkg
BB, 850 mgkg BB dosis 1000 mgkg BB dibagi 1,26.
13. Seleksi hewan uji
Hewan uji yang digunakan yaitu mencit putih betina galur Swiss, berat 20-30 gram, umur 2-3 bulan. Semua hewan uji dipelihara dengan kondisi
perlakuan yang sama meliputi: pakan, minum, kandang, dan alasnya. Sebelum digunakan dalam percobaan, semu hewan uji diadaptasikan terlebih dahulu
dengan kondisi yang sama. Bila akan digunakan dalam perlakuan, hewan uji dipuasakan terlebih dahulu selama ± 18-22 jam tanpa diberi makan, tetapi
tetap diberi minum. Hal ini bertujuan untuk mengurangi variasi akibat adanya makanan.
14. Perlakuan hewan uji
Hewan uji yang digunakan dalan penelitian ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu kelompok orientasi dan kelompok perlakuan. Pada kelompok
perlakuan, hewan uji dibagi secara acak menjadi enam kelompok meliputi: kelompok I yaitu kelompok kontrol negatif diberi CMC Na 1, kelompok II
yaitu kelompok kontrol positif diberi asetosal 91 mgkg BB, kelompok III-VI yaitu kelompok perlakuan diberi ekstrak etanol daun senggani dengan empat
peringkat dosis berturut-turut yaitu 850 mgkg BB, 1000 mgkg BB, 1330 mgkg BB, dan 1670 mgkg BB secara per oral. Sepuluh menit sesudah
perlakuan, hewan uji diinjeksi dengan asam asetat 1 dosis 50 mgkg BB secara intraperitoneal. Penentuan daya analgesik atau penghambatan terhadap
geliat dilakukan dengan pengamatan respon nyeri berupa geliat pada hewan uji akibat pemberian asam asetat tersebut. Pengamatan dilakukan tiap 5 menit
selama 60 menit. Data yang diperoleh berupa jumlah kumulatif geliat kemudian dihitung persen penghambatan terhadap geliat, yaitu:
penghambatan terhadap rangsang = 100 – [PK x 100]
Keterangan: P = jumlah kumulatif geliat hewan uji setelah pmberian obat yang telah ditetapkan
K = jumlah rata-rata geliat hewn uji kelompok kontrol
Perubahan persen penghambatan geliat terhadap asetosal dosis 91 mgkg BB sebagai kontrol positif pada tiap kelompok perlakuan dihitung
dengan rumus: perubahan penghambatan rangsang =
100 x
Kp Kp
P −
Keterangan: P = penghambatan terhadap geliat pada setiap kelompok perlakuan
Kp = rata-rata penghambatan terhadap geliat pada kelompok kontrol positif
G. Analisis Hasil
Data awal dianalisis dengan uji distribusi Kolmogorof-Smirnov. Setelah diketahui distribusi normal dilanjutkan dengan analisis statistik ANOVA satu arah
untuk melihat adanya perbedaab antar kelompok perlakuan. Untuk menguji PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
adanya perbedaan nyata antara kelompok satu dengan yang lain dilakukan uji Scheffe
dengan taraf kepercayaan 95. Pada penetapan kontrol negatif digunakan analisis Independent-Samples T-test dengan taraf kepercayaan 95 untuk
mengetahui adanya perbedaan di antara kedua perlakuan. Skema kerja penelitian dapat dilihat pada gambar 13.
Hewan uji 5 ekor kelompok Diberi perlakuan secara oral
Kontrol negatif
CMC Na 1
Kontrol positif
Asetosal 19 mgkg
BB Ekstrak
Senggani 850 mgkg
BB Ekstrak
Senggani 1000
mgkg BB Ekstrak
Senggani 1330
mgkg BB Ekstrak
Senggani 1670
mgkg BB
↓ Injeksi dengan asam asetat 1 dosis 50 mgkg BB secara intraperitoneal
↓ Hitung jumlah geliat tiap 5 menit selama 60 menit
↓ Hitung penghambatan terhadap geliat
↓ Hitung analisis statistik ANOVA satu arah
dilanjutkan dengan uji Scheffe dengan taraf kepercayaan 95
Gambar 13 . Skema kerja penelitian
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Senggani
Pembuatan ekstrak etanol daun senggani dilakukan dengan metode perkolasi. Metode perkolasi dipilih sebagai metode penyarian karena dengan
metode ini senyawa lebih mudah terekstrak, sehingga diharapkan senyawa yang terekstrak lebih banyak. Pelarut yang digunakan dalam proses penyarian yaitu
etanol 70. Sebelum dilakukan ekstraksi, daun senggani diserbuk terlebih dahulu. Hal
ini bertujuan agar kandungan fitokimia yang terkandung dalam daun Senggani lebih mudah terekstrak karena luas permukaan serbuk yang kontak dengan pelarut
semakin besar. Serbuk daun senggani sebanyak 300 gram direndam dengan menggunakan pelarut etanol 70 di dalam erlenmeyer selama 24 jam.
Perendaman ini bertujuan agar senyawa kimia yang terkandung dalam tumbuhan dapat larut dalam pelarut.
Setelah perendaman selama 24 jam, campuran serbuk daun senggani dan petroleum eter dimasukkan ke dalam perkolator. Kran perkolator dibuka dan
kecepatan penetesan larutan penyari adalah 3 ml permenit. Selama proses perkolasi berlangsung, tinggi pelarut harus tetap 1-2 cm di atas permukaan serbuk.
Perkolat ditampung dalam erlenmeyer. Perkolasi dihentikan jika perkolat yang diperoleh sudah tidak berwarna lagi bening. Perkolat yang diperoleh diuapkan di
atas waterbath hingga diperoleh perkolat yang kental pekat.
56 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kategori