23
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan penelitian acak lengkap pola searah.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
Variabel-variabel yang terdapat pada penelitian ini antara lain : a. Variabel bebas :
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah dosis infusa daun M. tanarius yang dibuat dalam tiga peringkat dosis. Dosis infusa daun M. tanarius adalah
volume ml infusa daun M. tanarius tiap satuan kg berat badan hewan uji yang bersangkutan.
b. Variabel tergantung : Variabel tergantung pada penelitian ini adalah kadar ALT-AST serum
pada tikus jantan galur Wistar yang terinduksi karbon tetraklorida CCl
4
setelah pemberian infusa daun M. tanarius.
c. Variabel pengacau terkendali : 1 Kondisi hewan uji, yaitu menggunakan tikus berjenis kelamin jantan,
dengan galur Wistar, berat badan 150-250, umur 2-3 bulan
2 Frekuensi pemberian infusa daun M. tanarius, diberikan 1x selama 6 hari berturut-turut pada waktu pemberian yang sama.
3 Cara pemberian senyawa uji dilakukan secara peroral dan pemberian hepatotoksin karbon tetraklorida diberikan secara intraperitonial.
4 Bahan uji yang digunakan berupa daun M. tanarius yang diambil di kebun obat Universitas Sanata Dharma dan diambil pada bulan Mei
2012. d. Variabel pengacau tidak terkendali :
Variabel pengacau yang tidak terkendali pada penelitian ini adalah kondisi patofisiologis hewan uji.
2. Definisi operasional
a. Infusa daun M. tanarius, merupakan hasil infudasi 50,0 g sebuk kering daun M. tanarius dalam 200,0 ml air pada suhu 90
C selama 15 menit. Serkai selagi panas dengan kain flannel, kemudian diuapkan dengan
waterbath hingga bobot infusa mencapai bobot yang sama dengan bobot serbuk kering daun M. tanarius yang sebelumnya diinfudasi sehingga
diperoleh infusa daun M. tanarius 100. b. Efek hepatoprotektif infusa daun M. tanarius, merupakan kemampuan
infusa daun M. tanarius untuk dapat melindungi hati dari adanya induksi suatu hepatotoksin.
C. Bahan Penelitian
1. Bahan utama
a. Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus jantan galur Wistar dengan range berat badan 150-250 g dan umur 2-3 bulan yang
diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
b. Bahan uji yang digunakan adalah daun tanaman M. tanarius yang diambil dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta
pada bulan Mei 2012.
2. Bahan kimia
a. Bahan hepatotoksin yang digunakan adalah karbon tetraklorida yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma dalam pelarut olive oil Bertolli. b. Pelarut untuk sediaan uji infusa adalah aquadest yang diperoleh dari
Laboratorium Farmakologi-Toksikologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
c. Reagen serum ALT yang digunakan adalah reagen serum ALT diasys, dengan komposisi sebagai berikut .
Tabel II . Komposisi reagen serum ALT diasys
Komposisi Jumlah
R1
TRIS pH 7.15 140 mmolL
L-Alanine 700 mmolL
LDH lactate dehydrogenase
2300 UL
R2
2-Oxoglutarate 85 mmolL
NADH 1 mmolL
Pyridoxal-5-phosphate FS :
Good’s buffer pH
9.6 100 mmolL
Pyridoxal-5-phosphate 13 mmolL
d. Reagen serum AST yang digunakan adalah reagen serum AST diasys, dengan komposisi sebagai berikut .
Tabel III . Komposisi reagen serum AST diasys
Komposisi Jumlah
R1
TRIS pH 7.65 110 mmolL
L-Aspartate 320 mmolL
MDH malate dehydrogenase
800 UL LDH lactate
dehydrogenase 1200 UL
R2
2-Oxoglutarate 65 mmolL
NADH 1 mmolL
Pyridoxal-5-phosphate FS :
Good’s buffer pH
9.6 100 mmolL
Pyridoxal-5-phosphate 13 mmolL
e. Kontrol serum Cobas PreciControl ClinChem Multi 1 RocheHitachi analyzer digunakan sebagai kontrol serum dalam validasi pengujian kadar
ALT-AST serum. f. Aqua bidestilata yang digunakan sebagai blanko dalam pengukuran kadar
ALT-AST serum diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
g. Olive oil Bertolli sebagai kontrol negatif.
D. Alat Penelitian
1. Alat pembuatan serbuk daun M. tanarius
Alat yang digunakan untuk pembuatan serbuk daun M. tanarius meliputi oven, mesin penyerbuk, dan timbangan analitik Mettler Toledo.
2. Alat pembuatan infusa daun M. tanarius
Alat yang digunakan untuk pembuatan infusa M. tanarius meliputi seperangkat alat gelas Bekker glass Iwaki Pyrex, gelas ukur Iwaki Pyrex, dan
batang pengaduk, cawan porselin, panci lapis alumunium, penangas air Memert, termometer, timbangan analitik Mettler Toledo, stopwatch, dan kain flanel.
3. Alat pengukuran kadar ALT-AST serum
Alat yang digunakan dalam pengukuran meliputi seperangkat alat gelas Bekker glass Iwaki Pyrex, gelas ukur Iwaki Pyrex, tabung reaksi dan batang
pengaduk, timbangan analitik Mettler Toledo, spuit injeksi intraperitonial dan peroral untuk tikus Terumo, pipa kapiler, Eppendrof, vortex Genie Wilten,
sentrifuge Centurium Scientific, stopwatch dan Microlab 200 Merck.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman M. tanarius dilakukan dengan mencocokan ciri-ciri tanaman M. tanarius dengan buku acuan Backer dan Bakhuizen, 1963.
Determinasi dilakukan oleh Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., dosen Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan uji
Bahan uji yang digunakan adalah daun M. tanarius yang masih segar dan berwarna hijau, dipetik dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta pada bulan Mei 2012.
3. Pembuatan serbuk
Daun segar M. tanarius yang telah dipetik dicuci bersih dan dikering anginkan. Setelah kering daun dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 50
o
C, dan disimpan selama 24 jam. Setelah daun benar-benar kering jika diremas timbul
bunyi renyah, daun kemudian diserbuk dan diayak dengan ayakan no.40 Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan Makanan, 1989 untuk memperkecil luas
permukaan agar mempermudah mengeluarkan kandungan fitokimianya.
4. Penetapan kadar air simplisia serbuk kering daun M. tanarius
Penetapan kadar air dilakukan termopan, yaitu dengan menguji susut penguapan dari simplisia serbuk daun M.tanarius Direktorat Jenderal Pengawas
Obat dan Makanan, 1989. Alat yang digunakan pada uji ini adalah Moisture Balance
yang terdapat di Laboratorium Kimia Analisis, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma. Pengujian dilakukan dengan cara memasukkan
sampel + 5 g sampel dan menimbang bobot simplisia sebagai bobot sebelum pemanasan bobot a. Kemudian alat dipanaskan pada suhu 110
C selama 15 menit, dan setelah menimbang bobot simplisia setelah pemanasan bobot b.
Selisih bobot a dan b merupakan kadar air dari simplisia yang diselidiki.
5. Pembuatan infusa daun M. tanarius
Untuk membuat infusa daun M. tanarius dengan konsentrasi 100 dimulai dengan mengambil 50,0 g serbuk kering daun M. tanarius ditambahkan
200,0 ml air. Campuran kemudian dipanaskan di atas heater dengan suhu 90 C
selama 15 menit. Waktu 15 menit dihitung ketika suhu telah mencapai 90 C, lalu
disaring menggunakan kain flanel untuk memisahkan infusa dan ampasnya. Kemudian infusa diuapkan di atas waterbath sampai diperoleh bobot infusa sama
dengan bobot serbuk kering daun M. tanarius yang digunakan untuk membuat infus.
6. Pembuatan larutan karbon tetraklorida 50
Berdasarkan penelitian Janakat dan Al-Merie 2002, larutan karbon tetraklorida dibuat dalam konsentrasi 50 dalam pelarut olive oil. Larutan karbon
tetraklorida dalam olive oil dibuat dengan cara mencampurkan karbon tetraklorida dan olive oil dengan perbandingan volume 1:1.
7. Uji pendahuluan
a. Penetapan dosis infusa daun M. tanarius
Penetapan dosis pemberian infusa daun M. tanarius mengacu pada penelitian Mahendra dan Hendra 2011 yang menyatakan dosis M. tanarius yang
diberikan adalah 2,5; 5; dan 10 gkg.
b. Penetapan dosis hepatotoksin CCl
4
Penetapan dosis karbon tetraklorida dilakukan untuk mengetahui pada dosis berapa karbon tetraklorida mampu menyebabkan kerusakan hati tikus yang
ditandai dengan peningkatan aktivitas ALT dan AST-serum paling tinggi. Dosis hepatotoksik yang digunakan dalam penelitian ini mengacu pada penelitian
Janakat dan Al-Merie 2002, bahwa dosis 2 mlkg BB pada konsentrasi 50 telah terbukti mampu meningkatkan aktivitas ALT-AST serum pada tikus bila
diberikan secara intraperitonial i.p. c.
Penetapan waktu cuplikan darah Penelitian Janakat dan Al-Merie 2002 mengenai optimasi dosis, rute
pemberian, dan karakteristik waktu pemberian karbon tetraklorida sebagai hepatotoksin menunjukkan bahwa aktivitas ALT-AST serum tikus terinduksi
karbon tetraklorida 2 mlkgBB mencapai maksimal pada jam ke-24 setelah pemberiannya, kemudian pada jam ke-48 berangsur-angsur menurun. Untuk
mendapatkan waktu cuplikan darah paling optimum dilakukan orientasi dengan cara membagi tikus dalam tiga kelompok masing-masing lima ekor dengan
waktu cuplikan 0, 24 dan 48 jam setelah pemejanan karbon tetraklorida kemudian diukur aktivitas ALT-AST serumnya.
8. Pengelompokan hewan uji
Sebanyak tiga puluh ekor tikus dibagi secara acak ke dalam enam kelompok perlakuan masing-masing kelompok lima ekor tikus. Kelompok I
kontrol negatif diberi olive oil dengan dosis 2 mlkgBB secara intraperitonial i.p. Kelompok II kontrol hepatotoksin diberi larutan karbon tetraklorida 50 2
mlkgBB secara i.p. Kelompok III kontrol infusa diberi infusa daun M. tanarius dosis 10 gkgBB secara peroral. Kelompok IV-VI berturut-turut diberi infusa daun
M. tanarius secara oral dengan dosis berturut-turut 2,5; 5; dan 10 gkgBB sekali sehari selama enam hari berturut-turut kemudian pada hari ke tujuh diberi larutan
karbon tetraklorida 50 dosis 2 mlkgBB secara i.p. Kemudian kelompok I-VI diambil darahnya melalui sinus orbitalis mata sesuai hasil orientasi waktu
penetapan pencuplikan darah, lalu diukur aktivitas ALT dan AST-nya.
9. Pembuatan serum
Darah diambil dari sinus orbitalis mata tikus kemudian ditampung pada tabung Eppendrof dan didiamkan selama 15 menit. Setelah itu darah
disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 3500 ppm. Bagian supernatan bening diambil.
10. Pengukuran aktivitas ALT-AST serum
Alat yang digunakan untuk menganalisis aktivitas ALT dan AST serum adalah Mikrolab 200 Merck di Laboratorium Biokimia-Fisiologi Manusia
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, dan hasil dinyatakan dengan satuan UL. Sebelum melakukan pengukuran sampel dilakukan validasi alat
menggunakan kontrol serum dengan range 33,9-48,9 UL. Analisis dilakukan dengan cara mencampur 100 µL serum dengan 800 µL reagen I, kemudian
dicampurkan 200 µL reagen II dan dibaca serapannya setelah satu menit. Pengukuran aktivitas serum ALT dan AST dilakukan di laboratorium Biokimia-
Fisiologi Manusia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Adanya hasil pengukuran aktivitas ALT-AST serum maka dapat ditentukan
pengaruh infusa daun M. tanarius dalam melindungi hati dengan menghitung efek hepatoprotektifnya menggunakan rumus sebagai berikut :
100 CCl
in hepatotoks
kontrol serum
- ALT
Aktivitas perlakuan
serum -
ALT Aktivitas
CCl in
hepatotoks kontrol
serum -
ALT Aktivitas
4 4
x
F. Tata Cara Analisis Hasil
Data aktivitas serum ALT dan AST dianalisis dengan metode Kolmogorov Smirnov untuk melihat distribusi data tiap kelompok. Jika didapatkan
distribusi data yang normal maka dilanjutkan dengan analisis pola searah One Way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95 dan dilanjutkan dengan uji Scheffe
atau Tamhane untuk melihat perbedaan antar kelompok bermakna signifikan p0,05 atau tidak bermakna tidak signifikan p0,05. Akan tetapi bila
didapatkan distribusi tidak normal, maka dilakukan analisis dengan uji Kruskal Wallis untuk mengetahui perbedaan aktivitas serum ALT dan AST antar
kelompok. Setelah itu, dilanjutkan uji dengan Mann Whitney untuk melihat perbedaan tiap kelompok.
33
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Penyiapan Bahan Uji
1. Hasil determinasi tanaman
Penelitian ini menggunakan serbuk kering daun M. tanarius . Sebelum melakukan penelitian lebih lanjut perlu dilakukan determinasi terlebih dahulu
untuk memastikan bahwa bagian tanaman yang digunakan benar berasal dari tanaman M. tanarius sehingga tidak terjadi kesalahan dalam penyiapan bahan uji
penelitian. Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
Determinasi ini dilakukan dengna mencocokan ciri tanaman dengan buku acuan yang tersedia Backer dan Bakhuizen, 1963 sampai ke tingkat spesies.
Hasil determinasi menunjukan bahwa tanaman yang diambil memang benar tanaman Macaranga tanarius L.
2. Penetapan kadar air serbuk kering M. tanarius
Penetapan kadar air perlu dilakukan dengan tujuan untuk memastikan bahwa serbuk kering yang digunakan memiliki kandungan air sesuai persyaratan
serbuk simplisia yang baik, yaitu kurang dari 10 Direktorat Jenderal Pengawas Obat dan Makanan, 1995. Penetapan kadar air serbuk kering daun M. tanarius
dilakukan dengan menghitung susut penguapan menggunakan terrmopan dengan alat Moisture Balance yang terdapat di Laboratorium Kimia Analisis Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Kategori