Persiapan Larutan Uji dan Larutan Kontrol Persiapan Inokulum

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator dan dikeringkan dengan gas nitrogen. Kemudian bobot fraksi ditimbang. Uji kemurnian fraksi dilakukan dengan menggunakan KLT dua dimensi. Dimana fraksi tunggal yang didapatkan dielusi menggunakan dua sistem elusi yaitu kloroform: metanol 7:1 dan kloroform: metanol 5:1.

3.4.6 Uji aktivitas antibakteri hasil purifikasi

Hasil purifikasi diuji aktivitas antibakterinya dengan menentukan nilai KHM Konsentrasi Hambat Minimum menggunakan metode mikodilusi cair pada suatu microwellplate yang berjumlah 96 sumuran. 3.4.6.1Persiapan Medium Medium pertumbuhan bakteri uji yang digunakan yaitu medium MHB dan MHA a. Medium MHB Mueller Hinton Broth dibuat dua komposisi, yaitu medium MHB 1 dibuat dengan melarutkan 21 g MHB dalam 1 L aquadest dan medium MHB 2 dibuat dengan komposisi dua kali medium MHB 1 42 g MHB dalam 1 L aquadest. Medium tersebut disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 C. b. Medium MHA Mueller Hinton Agar dibuat dengan melarutkan 38 g MHA dalam 1 L aquadest. Setelah larut, medium disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 C, kemudian dituang dalam cawan petri dan dibiarkan memadat.

3.4.6.2 Persiapan Larutan Uji dan Larutan Kontrol

Larutan uji yang digunakan yaitu fraksi F.5.8 a 4,5 mg dan F.5.8.b 5 mg. Larutan uji dipersiapkan dengan konsentrasi 1024 μgmL sebanyak 1 mL menggunakan pelarut etanol 20 . Pembuatan larutan uji dimulai dengan melarutkan masing-masing fraksi kedalam dalam 1 mL etanol 96, lalu dipipet sebanyak 1024 µL dari larutan tersebut ke dalam vial dan dipekatkan dengan nitrogen. Kemudian ditambahkan etanol 96 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta sebanyak 200 µL dan ditambah aquadest sebanyak 800 µL sehingga volume larutan menjadi 1 mL. Kloramfenikol dan eritromisin sebagai kontrol positif dipersiapkan dengan membuat larutan masing-masing dengan konsentrasi 10 mgmL dalam etanol 96 larutan stock. Kemudian diencerkan menjadi konsentrasi 512 µgmL sebanyak 5 mL, pembuatan larutan kontrol positif dibuat dengan dengan cara menambahkan 4744 µL aquadest ke dalam 256 µL larutan stock di dalam vial.

3.4.6.3 Persiapan Inokulum

Bakteri uji yang digunakan adalah Staphylococcus aureus dan Escherichia coli . a. Pembuatan suspensi inokulum Sebanyak masing-masing 1 ose isolat bakteri uji diinokulasikan ke dalam 20 mL medium MHB. Kemudian, diinkubasi selama 20 jam dalam shaker incubator pada suhu 37 C untuk memperoleh suspensi inokulum. b. Perhitungan jumlah koloni suspensi Suspensi yang didapat diencerkan untuk mempermudah perhitungan koloni, yaitu dengan cara dipipet 50 µL suspensi ke dalam 4,95 mL medium MHB. Suspensi tersebut diencerkan lagi dengan cara yang sama hingga didapat suspensi dengan pengenceran 10 -4 , 10 -6 , 10 -8 , dan 10 -10 . Suspensi dengan pengenceran diinokulasikan sebanyak 100 µL ke dalam medium MHA. Setelah itu diinkubasi selama 20 jam pada suhu 37 C. Koloni yang tumbuh dihitung. Jumlah koloni suspensi c. Pengenceran suspensi inokulum Setelah diketahui jumlah koloni suspensi, dilanjutkan dengan pengenceran suspensi inokulum untuk mendapatkan jumlah 10 5 CFUmL. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3.4.6.4 Penentuan Nilai Konsentrasi Hambat Minimum KHM