Waktu dan Tempat Alat dan Bahan Analisis kadar air AOAC 1995

3. METODOLOGI

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai dengan Juni 2009 di Laboratorium Karakteristik Bahan Baku, Laboratorium Pengolahan, Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Laboratorium Mikroteknik dan Anatomi Tumbuhan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Laboratorium Biologi Hewan dan Laboratorium Nutrisi dan Biologi Radiasi, Pusat Antar Universitas, Institut Pertanian Bogor.

3.2 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan untuk analisis histologi dalam proses pengukuran adalah penggaris stainless merk Kenko, kaca pembesar, dan jangka sorong. Dalam pembuatan preparat digunakan alat gelas penyimpan sampel, meja cetak, karton cetak, oven, mikrotom merk Yamator v-240, meja pemanas, gelas obyek, dan rak pewarna. Sedangkan untuk proses pengamatan digunakan mikroskop cahaya merk Olympus tipe CH20 dan kamera mikroskop merk Olympus DP12. Alat yang digunakan dalam analisis proksimat adalah timbangan, oven, wadah porselen, tanur, labu soxhlet, labu kjeldahl, alat destilasi, labu erlenmeyer, kertas saring, dan corong buchner. Alat yang digunakan dalam analisis mineral adalah oven, labu takar, labu kjeldahl, alat Atomic Absorption Spectrophotometer AAS Novva300, dan alat spektrofotometri Spektronik20. Bahan yang digunakan untuk pembuatan preparat bahan yang dibutuhkan meliputi, safranin, larutan FAA, etanol absolut, fast green, TBA, minyak parafin, parafin, xilol, etanol 95, etanol 70, etanol 50, etanol 30, akuades, safranin 2, fast-green 0,5. Bahan yang digunakan dalam analisis proksimat adalah larutan K 2 SO 4 , H 2 SO 4 , NaOH-Na 2 S 2 O 3 , H 3 BO 3 , asam klorida, larutan indikator, pelarut etil eter. Bahan yang digunakan dalam analisis mineral adalah daun dan tangkai tanaman semanggi, KH 2 PO 4, H 2 SO 4 , HNO 3 , akuades, ammonium molibdat, H 2 NO 3 , dan HClO 4 .

3.3 Metodologi Penelitian

Penelitian pendahuluan perlu dilakukan sebelum dilakukannya penelitian utama. Penelitian pendahuluan meliputi penghitungan ukuran semanggi air berupa panjang, lebar, dan tebal daun, serta panjang dan tebal tangkai. Sedangkan penelitian utama meliputi analisis histologi, uji kandungan gizi, dan uji kandungan mineral pada daun dan tangkai semanggi Marsilea crenata.

3.3.1 Penelitian pendahuluan

Langkah awal dalam penelitian ini adalah identifikasi terhadap tanaman yang akan diteliti untuk mendapatkan kepastian jenis atau spesies tanaman tersebut. Identifikasi tanaman semanggi dilakukan di Laboratorium Identifikasi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI. Tanaman semanggi yang didatangkan dari daerah Surabaya tersebut kemudian diukur morfologi daun dan tangkainya, sehingga didapatkan data ukuran panjang, lebar, dan tebal daun serta panjang dan tebal tangkai. Pengukuran panjang dan lebar daun menggunakan penggaris stainless stell dengan merk Kenko, sedangkan pengukuran ketebalan daun menggunakan jangka sorong merk NSK. Pengukuran panjang tangkai dan ketebalan tangkai dilakukan di tiga tempat berbeda, yaitu dekat daun, bagian tengah, dan bagian pangkal. Pengukuran panjang tangkai dilakukan menggunakan penggaris stainless stell merk kenko, sedangkan pengukuran ketebalan dilakukan menggunakan jangka sorong merk NSK. Setelah dilakukan pengukuran morfologi, sampel tanaman semanggi dibagi untuk analisis histologi dan uji proksimat serta kandungan mineral. Preparasi berupa pembuangan batang dan akar untuk kemudian diambil tangkai dan daunnya perlu dilakukan sebelum pengujian proksimat dan kandungan mineral baik dalam keadaan segar maupun kukus.

3.3.2 Penelitian utama

Penelitian utama tanaman semanggi terbagi menjadi lima tahap, yaitu analisis histologi, analisis proksimat daun semanggi segar dan kukus, serta uji kandungan mineral semanggi segar dan kukus. Kerangka penelitian dapat dilihat pada Gambar 13. Gambar 13. Kerangka penelitian utama

3.3.2.1 Analisis histologi

Hal yang dilakukan dalam analisis histologi adalah pembuatan preparat tumbuhan semanggi Marsilea crenata dan pengambilan foto objek pada mikroskop. Pembuatan preparat yang dilakukan menggunakan cara penanaman embidding dengan metode parafin. Langkah pertama yang dilakukan adalah persiapan berupa pemotongan sampel berupa bagian tumbuhan yang akan dianalisis kemudian dilanjutkan dengan proses fiksasi selama 24 jam dalam larutan FAA, setelah itu larutan fiksatif dibuang dan dicuci dengan etanol 50 sebanyak 4 kali dengan waktu penggantian masing-masing selama 1 jam. Kemudian dilakukan dehidrasi dan penjernihan secara bertahap melalui perendaman dalam larutan seri Johansen I-VII. Langkah selanjutnya adalah proses infiltrasi atau penyusupan parafin ke dalam jaringan, dengan cara bahan dimasukkan dalam wadah berisi campuran Tanaman semanggi Marsilea crenata Pengukuran Preparasi Pembuangan batang dan akar Analisis Histologi Daun dan Tangkai Semanggi Analisis Proksimat Analisis Kandungan Mineral Pengukusan Analisis Kandungan Mineral Analisis Proksimat TBA, minyak parafin, serta 13 parafin beku dan disimpan pada suhu kamar selama 1-4 jam yang dilanjutkan pengovenan pada suhu 58 C selama 18 jam. Pergantian parafin dilakukan setiap 6 jam sekali sebanyak 3 kali pergantian. Setelah itu proses penanaman dilakukan, dengan penggantian parafin dan penyimpanan dalam oven pada suhu ruang selama 1 jam. Setelah parafin mengeras, dilakukan penyayatan dengan mikrotom putar setebal 10 μm. Hasil sayatan kemudian direkatkan pada gelas obyek yang telah diolesi albumin-gliserin dan ditetesi air. Gelas berisi pita parafin kemudian dipanaskan pada hot-plate dengan suhu 45 o C selama 3 sampai 5 jam. Pewarnaan dilakukan dengan menggunakan safranin 2 dalam air dan fastgreen 0,5 dalam etanol 95. Pada proses pewarnaan ini gelas obyek direndam ke dalam larutan Xilol 1 dan 2 masing-masing selama 20 menit, dilanjutkan perendaman dalam Etanol absolut, 95, 70, 50, dan 30 masing- masing 5 menit. Setelah itu obyek dibilas dengan akuades dan dimasukkan ke dalam safranin 20 selama satu hari. Pada proses selanjutnya gelas obyek dibilas ke dalam akuades dan dimasukkan ke etanol 30, 50, 70, 95, dan absolut masing-masing selama 5 menit. Setelah itu obyek dimasukkan ke dalam pewarna fast-green 0,5 selama 30 menit. Gelas obyek kemudian direndam dalam xilol 1 dan xilol 2. Warna yang kontras diperoleh bila merah cemerlang : lignin, kromatin, kutin ; merah muda-merah : kloroplast ; hijau : dinding selulosa dan sitoplasma. Proses pewarnaan diikuti dengan proses penutupan atau pemberian media perekat yaitu entellan atau canada balsam pada gelas obyek dan ditutup dengan gelas penutup dan dikeringkan pada suhu 40 C. Setelah itu dilakukan pemberian label di sebelah kiri gelas obyek. Proses pemfotoan objek dilakukan dengan mikroskop cahaya dan kamera digital merk Olympus. Prosedur pembuatan preparat dapat dilihat pada Gambar 14. Gambar 14. Proses pembuatan preparat Fiksasi FAA ; 24 jam Pencucian Etanol 50 ; 4 kali 1 jam Dehidrasi dan Penjernihan Larutan seri johansen Infiltrasi TBA, minyak paraffin, 13 parafin beku ; 1-4 jam Penanaman Paraffin beku ; 1 jam Penyayatan Menggunakan mikrotom Perekatan Albumin-gliserin dan air Pewarnaan Safranin 2 dan fast green 0,5 Penutupan dan Pemberian Label Dengan perekat entellan atau kanada balsam Preparat Pengambilan Gambar

3.3.2.2. Analisis proksimat

Analisis proksimat merupakan suatu analisis yang dilakukan untuk mengetahui komposisi kimia yang ada pada suatu bahan. Analisis proksimat meliputi : analisis kadar air, abu, protein, lemak, dan karbohidrat.

a. Analisis kadar air AOAC 1995

Cawan kosong yang akan digunakan dikeringkan dalam oven selama 15 menit atau sampai didapat berat tetap, kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang. Sampel kira-kira sebanyak 2 gram ditimbang dan diletakkan dalam cawan kemudian dipanaskan dalam oven selama 3 – 4 jam pada suhu 105-110 ºC. Cawan kemudian didinginkan dalam desikator dan setelah dingin ditimbang kembali. Persentase kadar air berat basah dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut: Perhitungan kadar air pada daun semanggi : Kadar air = B - C x 100 B - A Keterangan : A = Berat cawan kosong gram B = Berat cawan dengan daun semanggi gram C = Berat cawan dengan daun semanggi setelah dikeringkan gram.

b. Analisis kadar abu AOAC 1995