Penelitian ini dirancang dengan menggunakan tiga kelompok hewan percobaan mencit putih Mus musculus, yang terdiri atas satu kelompok kontrol dan
dua kelompok yang diberi intervensi. Setelah delapan minggu, hasil yang diperoleh akan dianalisis untuk melihat ada tidaknya perbedaan pada ketiga kelompok
perlakuan tersebut. Perbedaan pada ketiga kelompok perlakuan menunjukkan adanya pengaruh perlakuan. Tidak dilakukan pretest pada seluruh kelompok eksperimen.
Kelompok perlakuan I langsung diberi paparan Pb plumbum asetat dan kelompok perlakuan II diberi Pb asetat bersamaan dengan madu.
4.2. Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini memerlukan waktu selama 12 minggu. Perawatan dan pemberian perlakuan pada hewan percobaan dilaksanakan di Laboratorium Biologi
FMIPA USU, dilanjutkan dengan pembuatan preparat histologi di Laboratorium Patologi Anatomi FK USU kemudian pengukuran diameter dan tebal epitel tubulus
seminiferus testis mencit dilakukan di Laboratorium Sitogenetik FK USU dan pengambilan gambar histologi dari preparat yang dilaksanakan di Laboratorium
Histologi Fakultas Kedokteran USU.
4.3. Populasi dan Sampel
Populasi penelitian ini adalah mencit jantan umur 8-11 minggu dengan berat badan 25-35 gram dan sehat yang ditandai dengan gerakan yang aktif dan diperoleh
dari Laboratorium Biologi FMIPA USU. Kerajaan
: Animalia Filum
: Chordata Kelas
: Mammalia Ordo
: Rodentia Famili
: Muridae Upafamili
: Murinae Genus
: Mus Spesies
: Mus musculus
Universitas Sumatera Utara
4.3.1. Kriteria Inklusi
1. Mencit jantan 2. Umur 8-11 minggu
3. Berat badan 25-35 gram
4.3.2. Kriteria Eksklusi
1. Terdapat abnormalitas anatomi yang tampak 2. Mencit tampak sakit, tidak bergerak aktif
4.4. Besar Sampel
Besar sampel yang digunakan pada penelitian ini ditentukan dengan menggunakan rumus besar sampel penelitian hewan coba Federer dalam Wahyuni
2008 :
Dengan ; t = kelompok perlakuan 3 kelompok
n = jumlah sampel tiap kelompok Banyak sampel yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah :
t-1 n-1 ≥ 15
3-1 n-1 ≥ 15
2n-2 ≥ 15
n ≥ 9
t-1 n-1 ≥ 15
Universitas Sumatera Utara
Dari hasil perhitungan di atas, dibutuhkan jumlah sampel sebanyak sembilan ekor mencit pada tiap kelompok sehingga total jumlah sampel yang dibutuhkan
adalah sebanyak 27 ekor mencit dengan perincian sebagai berikut : 1. K = kelompok kontrol yang diberikan aquadest sebanyak sembilan ekor
mencit selama delapan minggu. 2. P1 = kelompok perlakuan Pb asetat 100mgkgBBhari sebanyak sembilan
ekor mencit selama delapan minggu 3. P2 = kelompok perlakuan Pb asetat 100mgkgBBhari dan madu 0,04 ml20
grBBhari sebanyak sembilan ekor selama delapan minggu.
4.5. Pelaksanaan Penelitian
4.5.1. Penentuan Dosis Plumbum dan Dosis Madu
Pada penelitian ini, dosis Pb asetat yang diberikan adalah 100 mg kg BB hari Pangestuti, 2011. Pb asetat yang digunakan dalam bentuk serbuk yang
dilarutkan dengan aquades kemudian dimasukkan langsung ke lambung mencit dengan menggunakan jarum gavage per oral.
Madu yang digunakan dalam penelitian ini adalah madu murni yang terstandar sesuai dengan Standar Nasional Indonesia SNI dengan nama dagang
madu ‘Clover Honey’. Dosis madu yang diberikan adalah 0,04 ml20 grBBhari yang kemudian diencerkan dengan aquadest menjadi volume 0,2 ml merujuk pada
penelitian sebelumnya oleh Dewi 2010.
4.5.2. Pemeliharaan Hewan Coba
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan Mus musculus berumur 8-11 minggu dengan berat badan 25-35 gr. Kebersihan
Universitas Sumatera Utara
kandang selalu dijaga setiap hari agar mencit terhindar dari infeksi akibat kotorannya sendiri. Suhu kandang dijaga agar tetap dalam suhu ruangan dan pencahayaan
ruangan menggunakan cahaya lampu dan sinar matahari secara tidak langsung. Makanan yang diberikan berupa pelet dan jagung halus. Makanan dan minuman
diberikan secukupnya dalam wadah terpisah dan diganti setiap hari. Plumbum asetat dan madu diberikan pada mencit dengan menggunakan jarum gavage per oral.
4.5.3. Persiapan Hewan Coba
Masing–masing kelompok percobaan disiapkan dalam kandang yang terpisah. Mencit dipilih dan dipisahkan secara random dalam keadaan baik, dan
disiapkan untuk beradaptasi selama dua minggu sebelum dilakukan penelitian. Sebelum perlakuan, berat badan setiap mencit diukur dan diamati kesehatannya
secara fisik gerakan, berat badan, makan, dan minum. Jika ada mencit yang sakit pada saat adaptasi ini, maka diganti dengan mencit yang baru dengan kriteria sama
dan diambil secara acak Anggraini, 2008.
4.5.4. Perlakuan Hewan Percobaan
Setelah semua perlakuan selesai pada akhir minggu ke-8 , hewan percobaan pada tiap kelompok K, P1, dan P2 dikorbankan dengan cara dislokasi leher.
Selanjutnya, dilakukan pembedahan dengan cara mencit diletakkan pada bak bedah dengan keempat anggota gerak terfiksasi. Skrotum dibuka dengan gunting hingga
tampak testis. Testis diangkat dengan memotong duktus epididimis. Setelah dikeluarkan, testis dibersihkan dari jaringan ikat dan lemak Pangestuti, 2011.
4.5.5. Pembuatan Sediaan Histologi
Universitas Sumatera Utara
Sediaan histologis testis dibuat dengan metode parafin dan menggunakan pewarnaan HE Hematoksilin Eosin sebelum melakukan pengamatan diameter,
tebal dan jumlah tubulus seminiferus abnormal. Sesuai dengan cara yang lazim, pembuatan sediaan histologis dilakukan dengan cara sebagai berikut:
1. Fiksasi Jaringan testis diambil kemudian difiksasi dalam larutan formalin selama 2-
10 jam. 2. Pencucian
Setelah proses fiksasi, dilakukan pencucian dengan alkohol 70. 3. Dehidrasi
Dilakukan secara bertahap dengan menggunakan alkohol 70 selama 10 menit, alkohol 80, 90, 96, masing-masing selama 60 menit, lalu dengan
alkohol absolut 30 menit. 4. Penjernihan
Dilakukan segera setelah proses dehidrasi dengan menggunakan toluol murni. 5. Infiltrasi
Proses infiltrasi parafin dilakukan di dalam oven dengan suhu 56
o
C. Organ testis dimasukkan kedalam campuran toluol-parafin dengan perbandingan 1:1
selama 30 menit. Kemudian secara berturut dimasukkan kedalam: parafin murni I selama 1 jam
parafin murni II selama 1 jam parafin murni III selama 1 jam.
6. Penanaman Sediaan dari parafin murni III dimasukkan kedalam kotak kertas kecil
sebagai cetakan yang telah berisi parafin cair dan dibiarkan sampai parafin mengeras.
Universitas Sumatera Utara
7. Pengirisan Blok parafin testis yang telah mengeras ditempelkan pada holder dengan
menggunakan spatula, lalu letakkan holder beserta blok parafin pada tempatnya di mikrotom. Pengirisan dilakukan dengan ketebalan ± enam μm.
8. Penempelan Gelas benda diolesi dengan albumin dan ditetesi dengan aquadest. Kemudian,
beberapa pipa parafin diletakkan di permukaan aquadest pada gelas benda dan dibiarkan beberapa saat. Kemudian, gelas benda dipindahkan ke meja
pemanas hingga kering. 9. Pewarnaan
Pewarnaan dengan hematoxylin eosin melalui tahapan: • Deparafinisasi preparat dengan xylol sampai bebas parafin
• Hidrasi dengan alkohol 96, 90, 80, 70, 50, 30, aquadest • Inkubasi dalam larutan haematoxylin erlich selama 30 menit
• Cuci dengan air mengalir ± 10 menit • Dicelupkan kedalam aquadest
• Dimasukkan kedalam alkohol 30, 50, 70 • Dimasukkan kedalam larutan Eosin 0,5 selama tiga menit
• Dehidrasi dengan alkohol mulai dari 70, 80, 90 dan alkohol absolut • Dikeringkan dengan kertas penghisap
• Inkubasi dengan xylol selama satu malam • Preparat ditutup dengan gelap penutup setelah ditetesi dengan kanada
balsam terlebih dahulu, lalu diberi label. Pewarnaan dengan hematoksilin eosin akan menyebabkan inti sel berwarna
hitam kebiru-biruan dan sitoplasma berwarna merah. Selanjutnya dilakukan pengamatan histopatologis dengan menggunakan mikroskop sitogenetik
Pangestuti, 2011.
Universitas Sumatera Utara
4.6. Analisis Data
Data yang diperoleh dari hasil pengamatan mikroskopis testis akan dianalisis dengan SPSS 17. Terlebih dahulu dilakukan uji normalitas dan homogenitas data.
Jika data berdistribusi normal dan homogen, akan dilakukan uji ANOVA. Bila terdapat perbedaan, akan dilakukan uji Post Hoc untuk melihat perbedaan
antarkelompok kontrol dan masing-masing perlakuan. Jika data tidak berdistribusi normal dan atau tidak homogen, akan dilakukan
uji Kruskal Wallis. Untuk melihat perbedaan antar kelompok kontrol dan perlakuan menggunakan uji Mann Whitney.
Universitas Sumatera Utara
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1. Hasil