Pembuatan Sediaan Histologi Pelaksanaan Penelitian

kandang selalu dijaga setiap hari agar mencit terhindar dari infeksi akibat kotorannya sendiri. Suhu kandang dijaga agar tetap dalam suhu ruangan dan pencahayaan ruangan menggunakan cahaya lampu dan sinar matahari secara tidak langsung. Makanan yang diberikan berupa pelet dan jagung halus. Makanan dan minuman diberikan secukupnya dalam wadah terpisah dan diganti setiap hari. Plumbum asetat dan madu diberikan pada mencit dengan menggunakan jarum gavage per oral.

4.5.3. Persiapan Hewan Coba

Masing–masing kelompok percobaan disiapkan dalam kandang yang terpisah. Mencit dipilih dan dipisahkan secara random dalam keadaan baik, dan disiapkan untuk beradaptasi selama dua minggu sebelum dilakukan penelitian. Sebelum perlakuan, berat badan setiap mencit diukur dan diamati kesehatannya secara fisik gerakan, berat badan, makan, dan minum. Jika ada mencit yang sakit pada saat adaptasi ini, maka diganti dengan mencit yang baru dengan kriteria sama dan diambil secara acak Anggraini, 2008.

4.5.4. Perlakuan Hewan Percobaan

Setelah semua perlakuan selesai pada akhir minggu ke-8 , hewan percobaan pada tiap kelompok K, P1, dan P2 dikorbankan dengan cara dislokasi leher. Selanjutnya, dilakukan pembedahan dengan cara mencit diletakkan pada bak bedah dengan keempat anggota gerak terfiksasi. Skrotum dibuka dengan gunting hingga tampak testis. Testis diangkat dengan memotong duktus epididimis. Setelah dikeluarkan, testis dibersihkan dari jaringan ikat dan lemak Pangestuti, 2011.

4.5.5. Pembuatan Sediaan Histologi

Universitas Sumatera Utara Sediaan histologis testis dibuat dengan metode parafin dan menggunakan pewarnaan HE Hematoksilin Eosin sebelum melakukan pengamatan diameter, tebal dan jumlah tubulus seminiferus abnormal. Sesuai dengan cara yang lazim, pembuatan sediaan histologis dilakukan dengan cara sebagai berikut: 1. Fiksasi Jaringan testis diambil kemudian difiksasi dalam larutan formalin selama 2- 10 jam. 2. Pencucian Setelah proses fiksasi, dilakukan pencucian dengan alkohol 70. 3. Dehidrasi Dilakukan secara bertahap dengan menggunakan alkohol 70 selama 10 menit, alkohol 80, 90, 96, masing-masing selama 60 menit, lalu dengan alkohol absolut 30 menit. 4. Penjernihan Dilakukan segera setelah proses dehidrasi dengan menggunakan toluol murni. 5. Infiltrasi Proses infiltrasi parafin dilakukan di dalam oven dengan suhu 56 o C. Organ testis dimasukkan kedalam campuran toluol-parafin dengan perbandingan 1:1 selama 30 menit. Kemudian secara berturut dimasukkan kedalam: parafin murni I selama 1 jam parafin murni II selama 1 jam parafin murni III selama 1 jam. 6. Penanaman Sediaan dari parafin murni III dimasukkan kedalam kotak kertas kecil sebagai cetakan yang telah berisi parafin cair dan dibiarkan sampai parafin mengeras. Universitas Sumatera Utara 7. Pengirisan Blok parafin testis yang telah mengeras ditempelkan pada holder dengan menggunakan spatula, lalu letakkan holder beserta blok parafin pada tempatnya di mikrotom. Pengirisan dilakukan dengan ketebalan ± enam μm. 8. Penempelan Gelas benda diolesi dengan albumin dan ditetesi dengan aquadest. Kemudian, beberapa pipa parafin diletakkan di permukaan aquadest pada gelas benda dan dibiarkan beberapa saat. Kemudian, gelas benda dipindahkan ke meja pemanas hingga kering. 9. Pewarnaan Pewarnaan dengan hematoxylin eosin melalui tahapan: • Deparafinisasi preparat dengan xylol sampai bebas parafin • Hidrasi dengan alkohol 96, 90, 80, 70, 50, 30, aquadest • Inkubasi dalam larutan haematoxylin erlich selama 30 menit • Cuci dengan air mengalir ± 10 menit • Dicelupkan kedalam aquadest • Dimasukkan kedalam alkohol 30, 50, 70 • Dimasukkan kedalam larutan Eosin 0,5 selama tiga menit • Dehidrasi dengan alkohol mulai dari 70, 80, 90 dan alkohol absolut • Dikeringkan dengan kertas penghisap • Inkubasi dengan xylol selama satu malam • Preparat ditutup dengan gelap penutup setelah ditetesi dengan kanada balsam terlebih dahulu, lalu diberi label. Pewarnaan dengan hematoksilin eosin akan menyebabkan inti sel berwarna hitam kebiru-biruan dan sitoplasma berwarna merah. Selanjutnya dilakukan pengamatan histopatologis dengan menggunakan mikroskop sitogenetik Pangestuti, 2011. Universitas Sumatera Utara

4.6. Analisis Data