Real time Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

3. METODE PENELITIAN

3.1 Bahan dan Alat

Dalam pengambilan sampel, bahan dan alat yang diperlukan yaitu media transport berupa Brain Heart Infusion BHI dalam tabung berukuran 2 ml, sampel usap steril, syringe, kapas dan alkohol 70. Peralatan yang diperlukan selama pemerikasaan di laboratorium yaitu biosafety cabinet BSC, vortex, sentrifus, mikropipet, tips, alkohol, desinfektan, plat ekstraksi 96 sumuran, plat mikrotirasi 96 sumuran berdasar V, kulkas, freezer -20 o C dan freezer -80 o C. Pemeriksaan sampel dilakukan menggunakan real time RT-PCR dan uji Hemaglutinasi Inhibisi HI. Isolasi RNA virus dilakukan menggunakan MagMAX TM AIND Viral RNA Isolation kit dari Ambion®, plat ekstraksi 96 sumuran, dan magnetic stand. Alat dan Bahan untuk pengujian real time RT-PCR yaitu Ag-Path ID TM One-Step RT-PCR kit dari Ambion® dengan plat optik 96 sumuran pada mesin Applied Biosystem 7500 Real Time PCR System. Pada pengujian HI diperlukan larutan phosphate buffer saline PBS pH 7.2, red blood cell RBC ayam, plat mikrotitrasi 96 sumuran berdasar V, plat sentrifus, kontrol serum positif ALegokIPB-SGT12004 H5N1 dari PT IPB- Shigeta Animal Pharmaceuticals dan ACkWest JavaPWT-Wij2006 H5N1 dari Balai Besar Penelitian dan Veteriner, Bogor serta antigen H5 standar ALegokIPB-SGT12004 H5N1 dari PT IPB-Shigeta Animal Pharmaceuticals dan ACkWest JavaPWT-Wij2006 H5N1 dari Balai Besar Penelitian dan Veteriner, Bogor.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Pengambilan sampel untuk dianalisa pada penelitian ini dilaksanakan di Pasar Burung Pramuka, Jakarta secara cross-sectional pada bulan April sampai dengan September 2011. Pemeriksaan sampel dilaksanakan di Bagian Mikrobiologi Medik, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor IPB pada bulan Oktober 2011 sampai dengan Juni 2012. 3.3 Desain Penelitian 3.3.1 Pengambilan Sampel Pengambilan sampel dilakukan terhadap 30 kios secara cross sectional setiap bulannya di Pasar Burung Pramuka, Jakarta. Kios dipilih secara acak. Pengambilan sampel dilakukan satu bulan satu kali selama 6 bulan berturut-turut sebanyak 5 sampelkiosbulan Gambar 3. Sampel yang akan diambil langsung di lokasi yaitu feses, usap kloakal dan usap orofaringaltrakeal. Dari beberapa kios yang diambil sampel dibeli minimal satu ekor unggas yang selanjutnya diambil sampel usap orofaringealtrakeal, kloakal dan darah. Jumlah unggas yang dibeli setiap bulan adalah 30 ekor. Spesies unggas yang dibeli bervariasi. Sampel usap orofaringealtrakeal, kloakal dan fekal diambil menggunakan tip steril berbahan polyester dan disimpan di dalam tabung berisi Brain Heart Infusion BHI sesuai metode oleh National Veterinary Services Laboratories NVSL Killian 2008. Protein di dalam media transport virus dapat mencegah degradasi virus hidup selama penanganan dan transportasi ke laboratorium. Sampel darah dari unggas yang dibeli disimpan di dalam syringe sebelum dibawa ke laboratorium. Semua sampel diberi kode berdasarkan waktu pengambilan sampel, pedagang, jenis sampel dan spesies unggas Whitworth et al. 2007. Identifikasi unggas dilakukan berdasarkan informasi pedagang yang dicocokkan dengan metode identifikasi burung menurut MacKinnnon 1991, Gosler 2007, dan informasi dari internet. Sampel disimpan pada suhu ± 4 o C selama proses transportasi. Setelah tiba di laboratorium, sampel usap disimpan pada suhu di bawah -70 o C sedangkan serum disimpan pada suhu -20 o C WHO 2007, OIE 2009. Gambar 3 Desain Penelitian. Keterangan: F: fekal, K: usap kloakal, O: usap orofaringel, HI: Uji Hemaglutinasi Inhibisi, rRT-PCR: real time reverse transcriptase polymerase chain reaction.

3.3.2 Pengumpulan Data Epidemiologis

Responden yang diwawancara untuk mengumpulkan data epidemiologis merupakan pedagang pemilikpenjaga kios yang pernah diambil sampel. Komponen yang ditanyakan dalam wawancara menyangkut jumlah dan spesies unggas yang masuk dan dijual, asal unggas, cara memperoleh unggas dari penangkarantangkapan, dan lama unggas dipelihara oleh pedagang. Sumber data cuaca diperoleh dari Bagian Database Badan Meteorologi, Klimatologi, dan Geofisika BMKG Republik Indonesia. Adapun data cuaca yang dikaji yaitu rataan suhu bulanan, rataan kelembapan bulanan, dan rataan curah hujan bulanan yang dikoleksi oleh stasiun Priok, Jakarta.

3.3.3 Pemeriksaan Laboratorium

Sampel usap kloakal, orofaringeal dan fekal akan diuji terhadap keberadaan matriks dan H5 virus Avian Influenza VAI dengan menggunakan teknik real time reverse transcriptase polymerase chain reaction rRT-PCR. Sampel serum akan diperiksa menggunakan uji Hemaglutinasi Inhibisi HI untuk mengetahui keberadaan antibodi terhadap VAI H5. Pemeriksaan dilakukan di Bagian Mikrobiologi Medik, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.

3.3.3.1 Pooling

Sampel usap dikelompokkan berdasarkan jenis sampel sampel usap kloakal, usap orofaringeal dan fekal dan pedagang. Setiap kelompok pool berisi maksimal 5 sampel NVSL 2008 dimana dari setiap sampel diambil 100 µl selanjutnya dihomogenkan dengan vorteks. Setiap pool diperiksa menggunakan uji tapis terhadap keberadaan Matriks VAI. Apabila terdapat pool yang positif Matriks VAI, maka dilakukan pengujian H5 terhadap setiap sampel individu dalam pool tersebut.

3.3.3.2 Isolasi RNA

Isolasi RNA dilakukan menggunakan kit Isolasi MagMAX TM AIND Viral RNA dari Ambion®. Sebanyak 50 µl sampel dimasukkan ke dalam 100 µl buffer lisis pada plat ekstraksi 96 sumuran. Selanjutnya ditambahkan larutan beads manik-manik sangat kecil yang bersifat paramagnetik untuk mengikat RNA sebanyak 20 µl, diagitasi selama 4 menit, dan didiamkan di atas magnetic stand lempeng magnetik yang berfungsi mengendapkan beads paramagnetik ke dasar plat selama 2 menit. Supernatan dibuang dengan cara disedot dengan mikropipet. Plat diturunkan dari magnetic stand lalu ditambahkan 100 µl wash buffer I buffer pencuci I, diagitasi selama 30 detik dan didiamkan di atas magnetic stand selama 1 menit. Setelah itu, supernatan dibuang menggunakan mikropipet. Proses pencucian ini dilanjutkan menggunakan wash buffer II sebanyak dua kali. Pada tahap selanjutnya beads diagitasi selama 2 menit agar kering. RNA dielusi menggunakan 50 µl elution buffer kemudian plat diagitasi selama 3 menit lalu didiamkan di atas magnetic stand selama 1 menit untuk mengendapkan beads. Supernatan yang berisi RNA diambil dan dipindahkan ke dalam plat 96 sumuran yang baru. RNA tersebut digunakan sebagai cetakan template PCR atau disimpan pada suhu -80 o C sampai digunakan Desiliyarni 2006.

3.3.3.3 Real Time RT-PCR

Penyiapan campuran PCR dilakukan di atas blok dingin dalam biosafety cabinet BSC. Secara berurutan reagen PCR seperti yang tertulis pada Tabel 2 dicampur pada tabung berukuran 1.5 ml kemudian disimpan pada -20 o C hingga digunakan. Adapun primer dan probe yang digunakan tertera pada Tabel 3. Tabel 2 Campuran rRT-PCR Reagen Volumereaksi µl H 2 O 5.40 Primer forward 20 µM 0.50 Primer reverse 20 µM 0.50 Probe 10 µM 0.60 Fast MIX 5.00 Template 8.00 Volume total 20.0 Tabel 3 Primer dan probe yang digunakan Sekuens Referensi Primer matriks forward M+25 5’ 5’-AgATgAgTCTTCTAACCgAggTCg-3’ Heine et al. 2005, NVSL 2008 Primer matriks reverse M- 1243’ 5’-TgCAAAAACATCTTCAAg TCTCTG- 3’ Probe AIV Matriks M+64 5’DFAM-TCAggCCCCCTCAAAg CCgA-BHQ1-3 Primer H5 forward IVA D148 H5 5’-AAACAgAgAggAAATAAgT ggAgTAAAATT- 3’ Keawcharoen et al. 2008 Primer H5 Reverse IVA D149 H5 5’-AAAgATAgACCAgCTACCAT gATTgC- 3’ Probe AIV H5 H5+1637 5’d FAM-TCAACAg TggCgAg TTCCCTAgCA-BHQ1- 3’ Heine et al. 2005 dengan modifikasi, NVSL 2008 Ke dalam setiap sumur plat optik 96 sumuran dimasukkan 12 µl campuran PCR lalu ditambahkan 8 µl template hasil isolasi NVSL 2008. Plat ditutup dengan segel optik kemudian ditempatkan pada mesin Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System dengan kondisi suhu amplifikasi untuk gen Matriks Tabel 4 atau H5 Tabel 5. Tabel 4 Kondisi amplifikasi untuk rRT-PCR Matriks Siklus PCR Suhu Waktu Tahap I 1x Reverse transcription 50 o C 5 menit Denaturasi 95 o C 20detik Tahap II 45x Denaturasi 94 o C 3 detik Anealling+Ekstensi 60 o C 42 detik