Tabel 2 Campuran rRT-PCR
Reagen Volumereaksi µl
H
2
O 5.40
Primer forward 20 µM
0.50 Primer
reverse 20 µM 0.50
Probe 10 µM 0.60
Fast MIX 5.00
Template 8.00
Volume total 20.0
Tabel 3 Primer dan probe yang digunakan
Sekuens Referensi
Primer matriks forward
M+25 5’ 5’-AgATgAgTCTTCTAACCgAggTCg-3’ Heine et al. 2005,
NVSL 2008 Primer matriks reverse
M- 1243’
5’-TgCAAAAACATCTTCAAg TCTCTG-
3’ Probe AIV Matriks
M+64 5’DFAM-TCAggCCCCCTCAAAg
CCgA-BHQ1-3 Primer H5 forward
IVA D148 H5 5’-AAACAgAgAggAAATAAgT
ggAgTAAAATT- 3’
Keawcharoen et
al. 2008 Primer H5 Reverse
IVA D149 H5 5’-AAAgATAgACCAgCTACCAT
gATTgC- 3’
Probe AIV H5 H5+1637
5’d FAM-TCAACAg TggCgAg TTCCCTAgCA-BHQ1-
3’ Heine
et al. 2005 dengan
modifikasi, NVSL 2008
Ke dalam setiap sumur plat optik 96 sumuran dimasukkan 12 µl campuran PCR lalu ditambahkan 8 µl
template hasil isolasi NVSL 2008. Plat ditutup dengan segel optik kemudian ditempatkan pada mesin Applied Biosystems 7500
Real Time PCR System dengan kondisi suhu amplifikasi untuk gen Matriks Tabel 4 atau H5 Tabel 5.
Tabel 4 Kondisi amplifikasi untuk rRT-PCR Matriks
Siklus PCR Suhu
Waktu Tahap I 1x
Reverse transcription 50
o
C 5 menit
Denaturasi 95
o
C 20detik
Tahap II 45x Denaturasi
94
o
C 3 detik
Anealling+Ekstensi 60
o
C 42 detik
Tabel 5 Kondisi amplifikasi untuk rRT-PCR H5
Siklus PCR Suhu
Waktu Tahap I 1x
Reverse transcription 50
o
C 5 menit
Denaturasi 95
o
C 20detik
Tahap II 40x Denaturasi
95
o
C 3 detik
Anealling 56
o
C 32 detik
Ekstensi 72
o
C 10 detik
3.3.3.4 Uji Hemaglutinasi Inhibisi HI
Serum dari spesies selain ayam kadangkala menunjukkan hasil positif yang nonspesifik sehingga perlu dilakukan adsorbsi serum menggunakan RBC
ayam. Sebanyak 0.025 ml RBC ayam ditambahkan ke 0.5 ml serum spesies non ayam, dihomogenkan dan diinkubasi selama 30 menit. Selanjutnya, RBC
diendapkan melalui sentrifugasi 800 g selama 5 menit dan serum yang diadsorbsi dipisahkan OIE 2009. Sebelum diuji HI, serum diinaktifasi melalui pemanasan
pada penangas air dengan suhu 56
o
C selama 30 menit Kalthoff et al. 2008; Capua
dan Alexander 2009. Uji Hemaglutinasi Inhibisi dilakukan sesuai dengan metode
OIE 2009, sebagai berikut: 1.
Sebanyak 25 µl PBS dimasukkan ke dalam setiap sumur plat mikrotitrasi 96 sumuran berdasar V, sumur 1-12.
2. Sebanyak 25 µl serum dimasukkan ke sumur pertama.
3. Pengenceran bertingkat dua kali dilakukan dengan memasukkan 25 µl
serum dari sumur 1 ke sumur 2 dan dihomogenkan. Selanjutnya sebanyak 25 µl serum dari sumur kedua dipindahkan ke sumur ketiga, demikian
seterusnya. Hal yang sama juga dilakukan terhadap kontrol serum positif.
4. Sebanyak 25 µl 4 HAU antigen standar dimasukkan ke setiap sumur dan
diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang. 5.
Sebanyak 25 µl RBC 1 vv ditambahkan ke setiap sumur dan dihomogenkan
.
Larutan diinkubasi selama 40 menit pada suhu ruang 20
o
C atau sampai kontrol RBC hanya berisi 25 µl RBC 1 vv dan 50 µl PBS
telah mengendap dan membentuk formasi seperti “kancing”. 6.
Titer HI merupakan pengenceran tertinggi dimana serum dapat secara sempurna menginhibisi antigen sebanyak 4 HAU. Aglutinasi dinilai
dengan memiringkan plate. Hasil dinyatkan positif jika tidak terjadi aglutinasi dan negatif jika terjadi aglutinasi
.
Hasil divalidasi dengan kontrol negatif dan kontrol serum positif ALegokIPB-SGT12004
H5N1 dan ACkWest JavaPWT-Wij2006 H5N1.
3.4 Analisa Data
Data hasil pengujian laboratorium maupun data epidemiologis dianalisa secara deskriptif. Sampel lapang dianalisis berdasarkan spesies dan jumlah
unggas yang positif matriks VAI dan H5 serta asal unggas. Data sampel unggas yang dibeli dikaitkan antara hasil pemeriksaan rRT-PCR dengan hasil
pemeriksaan serologis uji hemaglutinasi inhibisi. Data epidemiologis pedagang, sumber unggas, cuaca dikaitkan dengan hasil pemeriksaan laboratorium.
4. HASIL
4.1 Kondisi Pasar Burung Pramuka, Jakarta
Pasar Burung Pramuka teletak di wilayah Jakarta Timur. Lokasi pasar ini cukup strategis karena dari depan dapat diakses dari Jl. Pramuka, Jl. Matraman, Jl.
Rawamangun dan Jl. Salemba. Sedangkan dari belakang, pasar ini dapat diakses dari Jl. Pembina, Jl. Penggalang, Jl. Utan Kayu dan Kayu Manis Gambar 4.
Gambar 4 Lokasi Pasar Burung Pramuka, Jakarta Timur maps.google.com.
Pasar Burung Pramuka didirikan sejak tahun 1976 dan merupakan pasar burung terbesar di Jakarta dengan luas lahan 5320 m
2
dan luas bangunan 5500 m
2
. Pasar Burung Pramuka terbagi dalam dua area, yaitu area lama dan baru. Area
lama hanya terdiri atas satu lantai sedangkan area baru terletak di sebelah timur dan terdiri atas empat lantai. Pada tahun 2011 tercatat terdapat 289 kios dan 152
pedagang di Pasar Burung Pramuka. Luas setiap kios beragam, mulai 3 m
2
sampai dengan 12 m
2
untuk setiap kios. Pasar Burung Pramuka dikelola oleh PD. Pasar Jaya dan berada di bawah Binaan Suku Dinas Peternakan dan Perikanan, Kota
Administrasi Jakarta Timur PD Pasar Jaya 2011. Komoditi dagang utama di Pasar Burung Pramuka berupa berbagai jenis
unggas dan perlengkapan terkait pemeliharaan unggas, misalnya pakan, kandang, sarang, jaring dan sebagainya. Selain itu, terdapat kios yang digunakan sebagai
perkantoran dan menjual makanan. Berdasarkan komoditi penjualannya, dari 289 kios, sebanyak 255 kios menjual unggas dan perlengkapan pemeliharaan unggas,
5 kios memberikan pelayanan jasa, 12 kios menjual makanan dan minuman, 7 kios digunakan sebagai kantor PD. Pasar Jaya, dan 10 kios tidak ditempati PD.
Pasar Jaya 2011.
