26
ml larutan buffer. Untuk pH 1 digunakan larutan buffer KCl 0,02 M sama dengan yang digunakan untuk analisis antosianin monomerik. Untuk pH 4,5 digunakan larutan
buffer CH3COONa 0,4 M sama dengan yang digunakan untuk analisis antosianin monomerik. Untuk pH 7 digunakan larutan buffer Merck yang terbuat dari kalium
dihidrogen fosfatdinatrium hidrogen fosfat. Kestabilan warna ekstrak bunga teleng pada pH 1 hingga 14 dipelajari dengan
mengukur absorbansi maksimum pada masing-masing pH setiap 7 hari selama 28 hari. Larutan pH 1 hingga 14 dibuat dengan melarutkan HCl atau NaOH dalam akuades
sehingga mencapai nilai pH yang diinginkan, yang diukur dengan pH meter. Sebanyak 10 ml sampel dicampurkan dengan 90 ml larutan pH 1 hingga 14, kemudian disimpan di
dalam botol vial coklat pada suhu ruang dan suhu 4
o
C refrigerator. Untuk mendapatkan panjang gelombang absorbansi maksimal dari masing-masing ekstrak pH
1 hingga 14, sampel dipindai dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm hingga 700 nm. Setiap 7 hari absorbansi setiap sampel diuji pada panjang gelombang
maksimalnya. Stabilitas warna dihitung dalam persen yang diperoleh dengan cara membagi absorbansi pada hari ke n dengan absorbansi pada hari ke 0.
C. Rancangan Percobaan
1. Optimasi proses ekstraksi antosianin bunga teleng
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan Box- Behnken dengan metode permukaan tanggap response surface methodology. Faktor
yang dipelajari dan masing-masing tarafnya disajikan pada Tabel 8. Tabel 8 Faktor dan taraf yang dipelajari di dalam penelitian
Faktor Satuan
Batas bawah -1
Batas atas 1
Waktu Blansir Menit
12 Suhu Ekstraksi
o
C 30
60 Lama Ekstraksi
Menit 30
120
Jika ada 3 faktor yang dipelajari dengan menggunakan rancangan Box-Behnken, maka ada 13 variasi yang perlu dicobakan. Selain itu diperlukan minimal 3 kali ulangan
27
percobaan pada center point 0,0,0. Pada penelitian ini digunakan 5 center point, sehingga jumlah variasi percobaan menjadi 17 Tabel 9.
2. Karakterisasi sifat antosianin bunga teleng
Aktivitas antioksidan ekstrak bunga teleng pada pH 1, 4,5 dan 7 masing-masing diuji sebanyak 3 kali triplo. Pengukuran serapan maksimal ekstrak bunga teleng pada
pH 1 hingga 14 selama penyimpanan dilakukan sebanyak dua kali ulangan duplo. Tabel 9 Rancangan percobaan dan respons yang diukur di dalam penelitian
Std Run
Waktu blansir
menit Suhu
Ekstraksi
o
C Lama
Ekstraksi Menit
Volum Ekstrak
ml Kadar
antosianin mgl
Kadar Total
Fenol mgml
1 1
30 75
3 2
60 75
7 3
45 120
12 4
6 60
120 13
5 6
45 75
5 6
45 30
15 7
6 45
75 17
8 6
45 75
9 9
6 30
30 4
10 12
60 75
2 11
12 30
75 11
12 6
30 120
6 13
12 45
30 8
14 12
45 120
16 15
6 45
75 14
16 6
45 75
10 17
6 60
30
D. Metode Analisis
1. Analisis Kadar Antosianin Monomerik AOAC 2005
Kadar antosianin monomerik dinyatakan sebagai kadar cyanidin-3-glycoside yang diukur dengan metode pH Differential. Untuk pengukuran ini diperlukan larutan buffer
28
pH 1 dan 4,5. Larutan buffer pH 1dibuat dengan melarutkan 1,864 g kalium klorida KCl dalam 960 ml akuades. Larutan kemudian diukur dengan pH-meter dan pH diatur
sehingga mencapai nilai 1 dengan menambahkan asam klorida HCl pekat. Larutan ini kemudian dipindahkan ke labu ukur 1 liter dan ditambahkan dengan akuades sampai
total volum mencapai 1 liter, sehingga diperoleh larutan buffer KCl 0,025 M pH 1. Larutan buffer pH 4,5 dibuat dengan cara melarutkan 32,814 g natrium asetat
CH
3
COONa dalam 960 ml akuades. Larutan kemudian diukur dengan pH-meter dan pH diatur sehingga mencapai 4,5 dengan menambahkan HCl pekat. Larutan kemudian
dipindahkan ke labu ukur 1 liter dan ditambahkan dengan akuades sampai total volum sama dengan 1 liter, sehingga diperoleh larutan buffer CH
3
COONa 0,4 M pH 4,5. Sebanyak masing-masing 0,2 ml ekstrak diencerkan dengan 1,8 ml larutan buffer
pH 1,0 dan larutan buffer 4,5. Absorbansi kedua sampel ini kemudian diukur pada panjang gelombang 510 nm dan 700 nm. Selisih absorbansi dihitung dengan rumus
sebagai berikut : A = A
510
A
700 pH 1,0
A
510
A
700 pH 4,5
Kadar antosianin monomerik cyanidin-3-glucoside equivalents dalam mgL
diperoleh dengan rumus sebagai berikut : A × MW × DF × 1000 × l
MW adalah berat molekul cyanidin-3-glucoside 449,2 gmol, DF adalah faktor pengenceran, adalah absorptivitas molar dari cyanidin-3-glucoside yang nilainya sama
dengan 26 900, dan l adalah lebar kuvet 1 cm.
2. Analisis Total Fenol Singleton Rossi 1965 diacu dalam Kalt et al. 2000
Penentuan kandungan total fenol dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteau dengan asam galat sebagai standar. Sebanyak 0,2 ml sampel direaksikan dengan 0,8 ml
larutan Natrium karbonat 20 dan 1 ml larutan Folin-Ciocalteau. Sampel didiamkan selama 1 jam, kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 765 nm. Untuk
membuat kurva kalibrasi sebanyak 0,2 ml larutan asam galat pada berbagai konsentrasi direaksikan dengan 0,8 ml larutan Natrium karbonat 20 dan 1 ml larutan Folin-
