Jenis dan Rancangan Penelitian Bahan Penelitian Alat Penelitian Analisis Hasil

34

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk dalam penelitian eksperimental menggunakan metode desain faktorial.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel Penelitian

a. Variabel bebas Komposisi Texapon ® N70 sebagai surfaktan dengan level rendah sebesar 1 gram dan level tinggi 2,5 gram, serta komposisi PEG 6000 sebagai basis krim dengan level rendah sebesar 2 gram dan level tinggi 6 gram. b. Variabel tergantung Sifat fisis krim ekstrak etil asetat tomat meliputi organoleptis, tipe krim, daya sebar, viskositas krim, ukruan droplet, serta stabilitas krim meliputi pergeseran viskositas dan pergeseran ukuran droplet. c. Variabel pengacau terkendali Kecepatan putaran mixer, lama pengadukan, kondisi bahan yang digunakan, dan kondisi penyimpanan sediaan krim. d. Variabel pengacau tak terkendali Perubahan suhu dan kelembaban ruangan tempat pembuatan dan penyimpanan krim.

2. Definisi Operasional

a. Ekstrak etil asetat tomat adalah konsentrat berupa cairan yang berasal dari buah tomat dan mengandung likopen dan ß-karoten dalam buah tomat yang larut pada pelarut etil asetat dengan prosedur sesuai dengan yang tertulis pada penelitian ini. b. Krim adalah krim yang mengandung ekstrak etil asetat tomat dengan komposisi seperti pada penelitian ini. c. Surfaktan adalah Texapon ® N70, yaitu surfaktan anionik yang bekerja dengan cara menurunkan tegangan antarmuka. d. Basis adalah PEG 6000, merupakan jenis basis larut air. e. Sifat fisis krim adalah parameter yang digunakan untk mengetahui kualitas fisik sediaan krim yang meliputi ukuran droplet dan viskositas. f. Stabilitas krim adalah parameter yang digunakan untuk mengetahui ada tidaknya perubahan krim dalam penyimpanan yang meliputi pergeseran viskositas dan pergeseran ukuran droplet ukuran droplet. g. Viskositas adalah hambatan krim yang didiamkan 48 jam setelah pembuatan untuk mengalir setelah adanya pemberian gaya. Viskositas yang diharapkan yaitu 100-125 d.Pa.s. h. Pergeseran viskositas adalah persentase dari selisih viskositas krim 48 jam setelah dibuat dengan viskositas krim setelah penyimpanan selama 28 hari. i. Ukuran droplet adalah besarnya ukuran droplet dalam sediaan krim yang dilihat dengan menggunakan mikrokop. Ukuran droplet yang diharapkan yaitu kurang dari 40 μm. j. Pergeseran ukuran droplet adalah persentase penambahan atau perubahan ukuran droplet dalam sediaan krim selama penyimpanan 28 hari. k. Faktor adalah besaran yang mempengaruhi respon, dalam penelitian ini yaitu emulsifying agent Texapon ® N70 dan basis PEG 6000. l. Level adalah tingkatan jumlah atau besarnya faktor dalam suatu penelitian, dalam penelitian ini terdapat dua level, yaitu level rendah dan level tinggi. m. Respon adalah hasil percobaan yang akan diamati perubahannya secara kuantitatif. Respon dalan penelitian ini yaitu viskositas dan ukuran droplet. n. Efek adalah perubahan respon yang disebabkan variasi level dan faktor. o. Desain faktorial adalah metode rasional untuk menyimpulkan efek dari besaran yang berpengaruh terhadap kualitas produk secara obyektif. p. Contour plot adalah garis-garis respon dari sifat fisis viskositas pada 100- 125 d.Pa.s dan ukuran droplet kurang dari 40 μm yang dibuat melalui persamaan desain faktorial. q. Superimposed contour plot adalah penggabungan garis-garis pada daerah optimum viskositas 100-125 d.Pa.s dan ukuran droplet 30-40 μm. r. Metode HET-CAM dapat digunakan untuk melihat adanya hemorage, lisis, dan koagulasi yang diakibatkan adanya pengaruh dari bahan yang disuntikkan.

C. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak etil asetat tomat, asam stearat kualitas farmasetis, PEG 6000 kualitas farmasetis, metil paraben kualitas farmasetis, trietanolamin kualitas farmasetis, propilenglikol kualitas farmasetis, Texapon ® N70 kualitas farmasetis, aquadest, dan metylen blue.

D. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah glassware PYREX- GERMANY, mixer Modifikasi USD, cawan porselen, pengaduk, waterbath, termometer, neraca analitik Mettler Toledo GB 3002, Viscotester seri VT 04 RION-JAPAN, heater, horizontal double plate, stopwatch, mikroskop Olympus CH2-Japan, dan software R-2.14.1.

E. Tata Cara Penelitian

1. Ekstraksi

Satu kilogram buah tomat segar dicuci dengan air mengalir kemudian diblender hingga halus. Buah tomat yang telah diblender kemudian dimasukkan ke dalam 4 buah Erlenmeyer 500 mL masing-masing 250 gram. Dilakukan penambahan 250 mL pelarut etil asetat ke dalam masing-masing Erlenmeyer. Kemudian tabung Erlenmeyer dilapisi dengan alumunium foil untuk mencegah terjadinya reaksi oksidasi likopen karena pengaruh cahaya. Setelah itu, dilakukan maserasi dengan cara pendiaman selama 7 hari dan dilakukan penggojogan berkala setiap harinya. Maserat dikeluarkan dari tabung Erlenmeyer, lalu ekstrak cair dipisahkan dari ampas dengan menggunakan saringan. Ekstrak cair yang diperoleh kemudian dimasukkan ke dalam corong pisah untuk memisahkan antara fase etil asetat dan fase air. Fase etil asetat diambil, kemudian etil asetat yang terkandung dalam ekstrak diuapkan dengan menggunakan vaccum rotary evaporator pada tekanan rendah dan suhu 40-60 o C hingga tidak ada pelarut yang menetes lagi dan hingga terbentuk ekstrak kental Narendran dkk., 2013. Ekstrak kental yang diperoleh kemudian dicampurkan dengan talkum ekstrak kental : talkum = 1 : 5 lalu diaduk hingga homogen. Kemudian ekstrak kering yang didapat disimpan pada tempat yang terlindung dari cahaya matahari.

2. Uji Kualitatif Antioksidan

Ekstrak kental tomat diteteskan pada bagian tengah kertas Whattmann. Kemudian diteteskan pula larutan DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil 0,2 pada seluruh bagian dari kertas Whattmann. Ditunggu beberapa saat dan diamati perubahan yang terjadi. Warna ungu pada bagian tengah kertas Whattmann akan memudar menunjukkan bahwa ekstrak kental tomat memiliki aktivitas antioksidan Elya dkk., 2013.

3. Formula Sediaan Krim

Formula yang digunakan dalam pembuatan krim ekstrak etil asetat tomat mengacu pada formula dalam Formularium Medicamentorium Selectum Ikatan Sarjana Farmasi Indonesia, 1971. Komposisi dari formula dapat dilihat pada tabel III. Tabel III. Formula acuan Ikatan Sarjana Farmasi Indonesia, 1971 Formula Komposisi Asam stearat 14,2 g Trietanolamin 1 g Gliserol 10 g Boraks 0,25 g Nipagin 0,1 g Nipasol 0,05 g Aquadest ad 100 mL Formula modifikasi berdasarkan hasil orientasi untuk formula krim 100 gram dapat dilihat pada tabel IV. Tabel IV. Formula modifikasi Formula Komposisi Asam Stearat 20 gram Trietanolamin 1,35 gram PEG 6000 2 - 6 gram Texapon ® N70 1 – 2,5 gram Metil Paraben 0,2 gram Propilen Glikol 5 gram Aquadest 60 mL Ekstrak kering tomat 6 gram Formula seperti pada tabel IV dibuat krim ekstrak etil asetat tomat dengan surfaktan Texapon ® N70 dan basis PEG 6000. Level rendah Texapon ® N70 adalah 1 gram dan level tinggi Texapon ® N70 adalah 2,5 gram. Sedangkan level rendah PEG 6000 adalah 2 gram dan level tinggi PEG 6000 adalah 6 gram. Penggunaan level rendah dan level tinggi tersebut berdasarkan studi pustaka dan hasil orientasi yang telah dilakukan. Tabel V. Rancangan formula desain faktorial Formula 1 g a g b g ab g Ekstrak Etil Asetat Tomat 6 6 6 6 Asam Stearat 20 20 20 20 Trietanolamin 1,35 1,35 1,35 1,35 PEG 6000 2 2 6 6 Texapon ® N70 1 2,5 1 2,5 Metil Paraben 0,2 0,2 0,2 0,2 Propilen Glikol 5 5 5 5 Aquadest 60 60 60 60 Total 95,55 97,05 99,55 101,05

4. Pembuatan Krim Ekstrak Etil Asetat Tomat

Asam stearat dilelehkan diatas waterbath pada suhu 70°C. PEG 6000 juga dilelehkan diatas waterbath pada suhu 70°C. Setelah PEG 6000 meleleh lalu dimasukkan Texapon ® N70, trietanolamin, propilen glikol, dan metil paraben. Kemudian fase minyak asam stearat dan fase air campuran PEG 6000, Texapon ® N70, trietanolamin, propilen glikol, dan metil paraben dituang ke dalam mortar hangat lalu diaduk dengan menggunakan mixer dengan kecepatan konstan, lalu ditambahkan ekstrak etil asetat tomat dan aquadest, lalu aduk hingga homogen dan terbentuk masa krim Young, 1972. Setelah terbentuk basis krim yang homogen kemudian ditunggu hingga dingin. Setelah itu, krim dimasukkan ke dalam tube atau wadah.

5. Orientasi Formula Krim Ekstrak Etil Asetat Tomat

Beberapa macam krim dibuat dengan membuat variasi pada jumlah Texapon ® N70 berturut-turut 0,5 gram, 1 gram, 1,5 gram, 2 gram, dan 2,5 gram. Masing-masing krim kemudian dilihat respon viskositas dan ukuran droplet setelah 48 jam. Irisan dari jumlah terkecil dan terbesar Texapon ® N70 dari kedua respon yang masih memberikan perubahan yang linear akan menjadi level rendah dan level tinggi pada penelitian ini. Beberapa macam krim dibuat dengan membuat variasi pada jumlah PEG 6000 berturut-turut 2 gram, 4 gram, 6 gram, 8 gram, dan 10 gram. Masing-masing krim kemudian dilihat respon viskositas dan ukuran droplet setalah 48 jam. Irisan dari jumlah terkecil dan terbesar PEG 6000 dari kedua respon yang masih memberikan perubahan yang linear akan menjadi level rendah dan level tinggi pada penelitian ini.

6. Evaluasi Formula Krim Etil Asetat Tomat

a. Pengujian organoleptis Uji organoleptis dilakukan dengan mengamati bau, warna, dan homogenitas sediaan krim pada 48 jam setelah pembuatan. b. Pengujian tipe emulsi dengan metode pewarnaan Sejumlah krim dioleskan pada gelas objek lalu ditambahkan satu tetes methylene blue. Selanjutnya dilakukan pengamatan secara mikroskopik untuk menentukan apakah emulsi dari sediaan krim tersebut bertipe MA atau AM. Jika menunjukkan warna seragam berarti tipe emulsi MA, karena air adalah fase luar. c. Pengujian pH Sejumlah krim dioleskan pada kertas pH universal dan kemudian ditentukan pH dari sediaan krim tersebut. d. Pengujian daya sebar Uji daya sebar dilakukan setelah 48 jam pembuatan sediaan krim. Uji dilakukan dengan cara menimbang krim seberat 1 gram, diletakkan di tengah horizontal plate. Diatas krim diletakkan horizontal plate dan pemberat sehingga total berat horizontal plate dan pemberat menjadi 125,0 gram, didiamkan selama 1 menit, kemudian diukur dan dicatat diameter penyebaran krim. e. Pengujian viskositas Uji viskositas dilakukan 5 kali yaitu setelah 48 jam pembuatan krim, pada penyimpanan krim 1 minggu, 2 minggu, 3 minggu, dan 1 bulan. Pengukuran viskositas dilakukan dengan menggunakan alat Viscotester seri VT 04 RION-JAPAN dengan cara memasukkan krim ke dalam wadah dan pasang pada portabel viscotester. Viskositas krim diketahui dengan mengamati gerakan jarum penunjuk viskositas. f. Pengujian mikromeritik ukuran droplet Uji mikromeritik dilakukan 5 kali yaitu setelah 48 jam pembuatan krim, pada penyimpanan krim 1 minggu, 2 minngu, 3 minggu, dan 1 bulan. Sebelum dilakukan pengukuran, perlu dilakukan kalibrasi pada lensa mikroskop. Cara pengujian mikromeritik yaitu sejumlah krim dioleskan pada gelas objek kemudian diletakkan di meja benda pada mikroskop. Diamati ukuran droplet yang terdispersi pada krim. Untuk menentukan objek digunakan pembesar lemah kemudian diganti pembesar kuat. Diameter droplet diukur sebanyak 500 droplet Martin dkk., 1993. Pengukuran ini dilakukan dengan metode mean. g. Uji Iritasi Primer dengan Metode HET CAM Telur ayam kampung yang digunakan adalah telur yang telah tumbuh menjadi embrio setelah dierami selama 8-12 hari. Kemudian buka cangkang telur pada bagian yang memiliki rongga udara. Kontrol positif NaOH 0,1 N dan kontrol negatif NaCl 0,9 diambil menggunakan spuit sebanyak 0,3 mL kemudian disuntikkan pada daerah pada membran yang dekat dengan pembuluh darah, kemudian amati perubahan yang terjdi pada pembuluh darah. Sedangkan untuk formula krim yang akan diuji diambil sebanyak 0,3 gram kemudian diletakkan pada pada daerah pada membrane yang dekat dengan pembuluh darah, kemudian amati perubahan pada pembuluh darah. Pengamatan reaksi CAM chorioallantoic membrane dilakukan selama 300 detik. Waktu timbulnya gejala diamati dan dicatat. Gejala- gejala yang diamati adalah hemoragi pendarahan, vascular lysis disintegrasi pembuluh darah, dan koagulasi denaturasi protein ekstra vaskular dan intra vaskular. Kemudian hasil yang diperoleh dimasukkan dalam rumus Irritataion Score IS. I S = 301 − 300 5 + 301 − 300 7 + 301 − 300 9 Hemorage time yaitu dimulai dalam detik reaksi hemoragi atau terjadi pendarahan pada CAM. Lysis time yaitu dimulai dalam detik lisis pembuluh darah hingga pembuluh darah hilang pada CAM. Coagulation time yaitu dimulai dalam detik pembentukan koagulan pada CAM Rudianto, 2010.

7. Validasi Formula Krim Ekstrak Etil Asetat Tomat

Validasi formula dilakukan dengan cara menentuakan daerah optimum hasil optimasi, kemudian berdasarkan superimposed contour plot maka diambil 1 titik untuk membuat formula validasi yaitu pada Texapon ® N70 1,5 gram dan PEG 6000 5,5 gram. Setelah itu dibuat formula dengan komposisi surfaktan dan basis yang telah ditentukan untuk dijadikan sebagai formula validasi. Kemudian formula yang dibuat dilakukan replikasi 3 kali. Krim yang telah terbentuk kemudian dilakukan pengujian viskositas dan ukuran droplet pada 48 jam setelah pembuatan.

F. Analisis Hasil

Data sifat fisis dan stabilitas krim yang diperoleh dianalisis sesuai dengan metode perhitungan desain faktorial. Dengan pendekatan desain faktorial untuk menghitung koefisien b , b 1 , b 2 , b 12 sehingga didapatkan persamaan Y = b + b 1 X 1 + b 2 X 2 + b 12 X 1 X 2 . Persamaan desain faktorial yang didapat digunakan untuk membuat contour plot viskositas dan ukuran droplet krim ekstrak etil asetat tomat. Dari masing-masing contour plot digabungkan menjadi superimposed contour plot untuk mengetahui daerah optimum komposisi Texapon ® N70 dan PEG 6000, terbatas pada level yang diteliti. Analisis data dilakukan dengan bantuan software R-2.14.1 dengan berbagai uji statistik yang dilakukan, antara lain: Shapiro-Wilk untuk mengetahui normalitas distribusi data dan Levene’s Test untuk mengetahui kesamaan varians. Apabila data yang diuji memenuhi persyaratan uji statistik parametrik, maka dilanjutkan dengan uji ANOVA untuk melihat signifikansi dari setiap faktor Texapon ® N70, PEG 6000, serta interaksinya dalam mempengaruhi respon. Signifikasi data dapat dilihat dari nilai p-value. Namun, apabila tidak memenuhi persyaratan uji parametrik, maka dilanjutkan dengan uji Kruskal- Wallis dengan post hoc Wilcoxon Faktor yang dominan dalam mempengaruhi respon viskositas dan ukuran droplet ditentukan dari faktor yang memiliki nilai efek tertinggi dan signifikan terhadap respon, serta tidak ada interaksi dengan faktor lain yang berpengaruh signifikan terhadap respon. 47

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pembuatan Ekstrak Etil Asetat Tomat

1. Pengumpulan Bahan dan Determinasi Tanaman

Buah tomat yang digunakan dalam penelitian perlu dipastikan kebenaran spesiesnya dengan melakukan determinasi. Determinasi buah dilakukan dengan membandingkan ciri-ciri morfologi buah dengan kunci determinasi yang mengacu pada pustaka Flora of Java Volume II. Hasil determinasi menunjukkan bahwa buah tersebut merupakan buah dari tanaman Lycopersicon lycopersicum L. Karsten. Pengumpulan bahan dilakukan pada tempat penjualan buah tomat yang sama dan pada bulan yang sama dengan tujuan untuk mendapatkan keseragaman hasil dari proses ekstraksi. Kondisi buah tomat yang dipilih yaitu buah yang masih segar, utuh, dan berwarna merah untuk menghindari adanya kemungkinan kerusakan atau berkurangnya kandungan kimia pada buah yang dapat disebabkan oleh serangan hama atau perlakuan yang kurang tepat. Sortasi basah dilakukan dengan mencuci buah menggunakan air mengalir, bertujuan untuk menghilangkan pengotor, seperti serangga, debu, atau bahan- bahan asing lainnya yang dapat mengganggu perolehan hasil pada penelitian.