BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Alat
Alat–alat yang digunakan pada penelitian ini yaitu kromatografi cair kinerja tinggi Waters510 Pump, waters kolom C18 3,9x150 mm, detektor UV 280 nm,
mikropipet Socorex 10- 100 μl, mikropipet syringe 50 μl, vortex mixer fisher
scientific, sentrifuge Thermo biofuge primo R, rotary vacum evaporatorBUCHIR- 210R-215, pipet volum, labu takar dan alat gelas lain yang umum digunakan di
laboratorium analisis.
3.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian yaitumetanol pro HPLC, asetonitril pro HPLC, asam asetat glasial, etil asetat pro analisis, tersier butil hidrokuinon
TBHQ,membran penyaring 0.45 μm cellulose nitrat membrane filter PTFE,
minyak goreng dan aquabidest.
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Preparasi sampel
Sampel minyak goreng yang dipilih dalam penelitian ini adalah minyak goreng komersil yang pada kemasannya tertera mengandung antioksidan TBHQ sampel A.
Untukpenyiapan sampel minyak goreng pemakaian berulang,dilakukan penggorengan tempe mentahdengan pengulangan sebanyak 3 tiga kali. Pertama, sebanyak 5000
mL sampel A dipanaskan hingga suhu ± 150-160
o
C kemudiandigoreng ± 0,5 kg tempe mentah dan selanjutnya minyak didinginkan sampel B. Kedua,
digorengkembali tempe mentah menggunakan sampel B ± 0,5 kg tempeL minyak danminyak didinginkan kembali sampel C. Ketiga, sampel C digunakan kembali
menggoreng tempe mentah ± 0,5 kg tempeL minyak dan selanjutnya didinginkan sampel D.
Universitas Sumatera Utara
3.3.2 Penyiapan larutan standar TBHQ
Sebanyak 100 mg standar tersier butil hidroksi kuinon TBHQ dilarutkan dengan metanol di dalam labu ukur 100 mL, kemudian diencerkan hingga tanda batas untuk
mendapatkan konsentrasi larutan standar 1000 ppm.
3.3.3 Optimasi sistem KCKT
Optimasi sistem dilakukan dengan penyiapan alat KCKT dan sebanyak 20 μl larutan
standar TBHQ 50 ppm diinjeksikan ke dalam sistem KCKT menggunakan komposisi fasa gerak campuran metanol : asetonitril : asam asetat 1 60:20:20, 60:25:15,
60:30:10 dengan laju alir yang berbeda yaitu 0,5 mLmenit, 1 mLmenit dan 1,5 mLmenit Tabel 3.1. Setelah itu, dicatat waktu retensi dan ditentukan kondisi
optimum dari setiap penyuntikan dengan berbagai perbandingan komposisifasa gerak dan laju alir.
Tabel 3.1 Perbandingankomposisi campuran fasa gerak
Metanol Asetonitril
Asam asetat 1
60 20
20 60
60 25
30 15
10
3.3.4 Validasi metode KCKT 3.3.4.1 Uji linieritas
Larutan standar TBHQ 1000 ppm diencerkan menjadi konsentrasi 10, 25, 50, 100, 150, 200 dan 250 ppm. Setelah itu, sebanyak 20
μlmasing-masing larutan standar diinjeksikan ke dalam KCKT.Derajat kelinieran dihitung berdasarkan regresi linear
dari kurva kalibrasi yang diperoleh.
3.3.4.2Uji akurasi Harmita, 2004
Universitas Sumatera Utara
Pada penetapan persen perolehan kembali dilakukan analisis awal pada minyak goreng komersil yang pada kemasannya tidak tertera adanya antioksidan TBHQ
blanko. Selanjutnya sebanyak 0,025 gr antioksidan TBHQ ditambahkan kedalam blanko, kemudian diaduk dengan pengaduk magnet selama 15 menit pada suhu 40
o
����� ������ ������ℎ�� ������� = �
�
− �
�
�
�∗
× 100 17 C.
Setelah itu, diencerkan denganmenambakanminyak goreng hingga volumenya menjadi 50 mL 500 ppm. Larutan ini selanjutnya diencerkan secara bertingkat
hingga diperoleh konsentrasi antioksidan TBHQ di dalam minyak goreng yaitu 50, 100, 150 dan 200 ppm.Minyak goreng dengan masing-masing konsentrasikemudian
ditetapkan kadarnya dengan cara yang sama pada penetapan kadar TBHQ sampel minyak goreng 3.3.5. Nilai persen perolehan kembali recovery dihitung
menggunakan persamaan berikut:
dimana, C
b
C = konsentrasi sampel yang diperoleh setelah penambahan analit
a
Ca =konsentrasi analit yang ditambahkan = konsentrasi sampel sebelum penambahan analit
3.3.4.3 Uji Presisi Harmita, 2004
uji keseksamaan dilakukan secara intraday dan interday pada standar TBHQ. Uji keseksamaan intra-day,
sebanyak 20 μl larutan standar TBHQ 100 ppm diinjeksikan ke dalam KCKT dengan enam kali pengulangan pada hari yang sama.Sedangkan
untuk inter-day, diinjeksikan dengan tiga kali pengulanganpada hari yang berbeda. Keseksamaan ditentukan dengan parameter standar deviasi relatif RSD dengan
persamaan sebagai berikut:
��� = ��
�� × 100 18
Universitas Sumatera Utara
dimana, RSD = standar deviasi relatif SD = standar deviasi
�� = kadar rata-rata
3.3.4.4 Penentuan limit deteksi Harmita, 2004
Sebanyak 2 0 μl masing-masing larutan standar TBHQ dengan konsentrasi 6, 7, 8, 9
dan 10 ppmdiinjeksikan ke dalam KCKT. Kemudian dihitung limit deteksi LOD dengan menggunakan persamaan berikut:
�� = � � − ��
2
� − 2 19
����� ������� ��� = 3 ×
�� �����
20
Keterangan: SB = Simpangan baku
LOD = Batas deteksi
3.3.4.5Penetapan kadar TBHQ Xijin dan Zhicai, 2011
Sebanyak 10 g sampel minyak goreng sampel A ditempatkan dalam tabung sentrifuse. Setelah itu ditambahkan 20 mL campuran metanol : asetonitril 1:1 dan
dikocok menggunakan vorteks selama 15 menit. Sampel yang telah diekstrak selanjutnya diputar pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit dan supernatan hasil
sentrifuse dipisahkan dari residunya. Ektraksi diulangi kembali dengan menambahkan 25 mL metanol : asetonitril 1:1, lalu dikocok selama ± 1 menit menggunakan
vorteks. Selanjutnya sampel diputar pada kecepatan 3000 rpm selama 15 menit dan supernatan dipisahkan dari residunya. Supernatan hasil ekstraksi dikumpulkan dan
disaring dengan membran penyaring 0,45 μm. Filtratnya kemudian dievaporasi
Universitas Sumatera Utara
dengan rotary vakum evaporator pada suhu 40
o
C dan diencerkan hingga volumenya 10 mL.
Sebanyak 20 μL filtrat diinjeksikan ke dalam KCKT pada kondisi fasa gerak dan laju alir optimum. Perlakuan yang sama dilakukan untuk penetapan kadar TBHQ
pada sampel B, C dan D.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Penelitian 3.4.1 Preparasi sampel minyak goreng
Sampel A Minyak goreng
Dipanaskan T: 150-160
o
C Digoreng tempe 0,5 kg tempe L minyak
Didinginkan
Dipanaskan T: 150-160
o
C Digoreng tempe 0,5 kg tempe L minyak
Didinginkan Sampel B
penggorengan pertama Minyak goreng
Sampel C penggorengan kedua
Sampel D penggorengan ketiga
Dipanaskan T: 150-160
o
C Digoreng tempe 0,5 kg tempe L minyak
Didinginkan Minyak goreng
Minyak goreng
Universitas Sumatera Utara
3.4.2Optimasi sistem KCKT
Alat KCKT
Optimasi sistem
Pengkondisian Kolom = C-18 10 µm
Detektor = UV λ=280 nm Fasa gerak = metanol : asetonitril : asam asetat 1
60 : 20 : 20; 60 : 25 : 15 dan 60 : 30 : 10 Laju alir = 0,5 mLmenit; 1 mLmenit dan 2 mLmenit
Suhu oven kolom = 30
o
C Tekanan
≤ 200 bar
Kondisi optimum Injek larutan baku TBHQ
Uji Validasi
Linieritas Akurasi
kecermatan Presisi
keseksamaan Limit Deteksi
LOD
Universitas Sumatera Utara
3.4.3Penetapan kadar TBHQ dalam minyak goreng
Dievaporasi T: 40
o
C Disaring dengan membran 0,45 μm
Filtrat diencerkan hingga volumenya 10 mL Diektraksi dengan 20 mLACN : MeOH 1:1, v
Divortek t: 1 m Disentrifuse t: 15 m, r: 3000 rpm
Minyak
HPLC Supernatan II
10 g minyak goreng sampel A, B, C dan D
Diektraksi dengan 20 mLACN : MeOH 1:1, v Divortek t: 1 m
Disentrifuse t: 15 m, r: 3000 rpm
Supernatan I Minyak
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Optimasi Sistem KCKT
Pada penelitian ini, telah dilakukan optimasi fasa gerak dan laju alir dalam sistem KCKT. Variabel tetap yang digunakan pada optimasi adalahfase diam kolom C18,
detektor UV λ=280 nm, suhu kolom 30
o
C dan tekanan 200 bar. Sedangkan variabel berubahnya adalah perbandingan komposisi fasa gerak metanol : asetonitril : asam
asetat 1 60:20:20, 60:25:15 dan 60:30:10 serta laju alir 0,5 mLmenit,1 mLmenit dan 1,5 mLmenit.
Tabel 4.1 Data waktu retensi dan luas area tersier butil hidrokuinon TBHQ
konsentrasi 50 ppmmenggunakan komposisi fasa gerak 60:20:20; 60:25:15; 60:30:10 dengan laju alir 0,5; 1,0; 1,5 mLmenit
Fasa gerak metanol : Asetonitril : As. Asetat 1
Laju alir mLmenit
Tersier butil hidrokuinon Waktu retensi
menit Luas
arearata- rata
60 : 20 : 20 0,5
2.27 3231173
1,0 1,20
1605636 1,5
0,80 1379254
60 : 25 : 15 0,5
2.20 2962816
1,0 1.13
1599876 1,5
0,73 1084103
60 : 30 : 10 0,5
2,07 2542792
1,0 1,07
1388827 1,5
0,73 921696
Berdasarkan hasil analisis larutan standar antioksidan TBHQ menggunakan beberapa perbandingan komposisi fasa gerak dan laju alir, diperoleh fasa gerak dan
laju alir yang baik untuk analisis minyak goreng menggunakan KCKT. Komposisi
Universitas Sumatera Utara
Kategori