Pembuatan Fase Gerak HASIL DAN PEMBAHASAN

27

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Pembuatan Fase Gerak

Fase gerak yang digunakan dalam sistem KCKT fase terbalik adalah campuran metanol dan 0,01 M bufer fosfat pH 3 dengan perbandingan 40 : 60 dan kecepatan alir 0,9 mLmenit. Campuran metanol dan bufer fosfat bersifat polar sedangkan kolom Phenomenex® C 18 yang digunakan sebagai fase diam bersifat lebih nonpolar, sehingga metode KCKT ini merupakan metode KCKT fase terbalik. Sistem elusi fase gerak yang digunakan dalam penelitian adalah isokratik karena pada sistem ini tidak dilakukan perubahan perbandingan selama proses elusi. Prinsip kerja KCKT adalah memisahkan solut karena adanya perbedaan kecepatan elusi saat melewati kolom KCKT. Pemisahan ini terjadi karena adanya interaksi antara analit, fase diam, dan fase gerak Rohman, 2009. Interaksi yang terjadi diantara fase diam dan asam askorbat adalah interaksi gaya London, yang ditunjukkan pada Gambar 3. Interaksi gaya London ini merupakan gaya tarikan lemah yang disebabkan oleh dipol induksi sesaat pada suatu atom yang terjadi karena pergerakan elektron dalam suatu orbital Levita dan Mustarichie, 2012. Interaksi asam askorbat dan fase gerak metanol dan bufer fosfat merupakan interaksi hidrogen yang ditunjukkan pada Gambar 4. Interaksi hidrogen merupakan interaksi dipol-dipol yang terbentuk antara suatu hidrogen yang terikat pada gugus yang memiliki atom elektronegatif dengan suatu atom elektronegatif lain yang memiliki pasangan elektron bebas. Interaksi gaya London Gambar 3. Interaksi asam askorbat dengan fase diam oktadesilsilan Gambar 4. Interaksi asam askorbat dengan fase gerak metanol : bufer fosfat Larutan bufer fosfat terdiri dari KH 2 PO 4 , aqua demineralisata, dan asam fosfat. Aqua demineralisata digunakan sebagai pelarut karena air ini bebas ion atau mineral karena ion seperti ion tembaga dan besi, ion hidroksida dan kuinon dapat menyebabkan kecepatan degradasi asam askorbat menjadi asam dehidroaskorbat meningkat Wechtersbach and Cigic, 2007. Metanol dan bufer fosfat digunakan sebagai fase gerak karena dapat melarutkan asam askorbat dengan baik, tidak berinteraksi dengan analit, tidak toksik, dan memiliki nilai UV cut-off jauh dari panjang gelombang asam askorbat, metanol memiliki nilai UV cut-off 205 nm Rohman dan Gandjar, sedangkan nilai UV cut-off bufer fosfat di bawah 200 nm Supelco, 2001. Penggunaan bufer fosfat sebagai fase gerak agar pH dalam kolom dapat relatif stabil sehingga waktu retensi yang dihasilkan oleh senyawa asam askorbat menjadi reprodusibel selama tiga menit. Fase gerak disaring terlebih dahulu menggunakan kertas saring Whatman dengan bantuan pompa vakum untuk menghilangkan partikel-partikel kecil yang dapat menyumbat kolom, kemudian fase gerak didegassing dengan ultrasonicator untuk menghilangkan gelembung-gelembung udara yang dapat menggangu pengukuran. Larutan metanol dan bufer fosfat masing-masing ditempatkan di dalam chamber fase gerak dengan kapasitas 500 mL.

B. Pembuatan Larutan Baku Asam Askorbat