Asam askorbat antioksidan dapat menyerap radiasi pada daerah ultraviolet karena senyawa ini memiliki gugus kromofor dan auksokrom yang
ditunjukkan pada Gambar 6 Ahuja dan Dong, 2005. Kromofor adalah gugus fungsional tak jenuh yang dapat menyerap radiasi pada daerah ultraviolet dan
sinar tampak Gandjar dan Rohman, 2007, sedangkan auksokrom adalah gugus jenuh yang bila terikat pada kromofor dapat mengubah panjang gelombang dan
intensitas serapan maksimum Sastrohamidjojo, 2001. Asam askorbat dalam larutan asam pada panjang gelombang 243 nm memiliki nilai absorptivitas:
=556a. Nilai tersebut dapat menunjukkan bahwa senyawa asam askorbat dapat dideteksi dengan spektrofotometer UV-Vis. Nilai absorptivitas molar
asam askorbat adalah 9791,15 M
-1
.cm
-1
. Nilai tersebut menunjukkan bahwa
asam askorbat akan mengalami transisi dan dapat diaplikasikan pada
daerah ultraviolet Rohman dan Gandjar, 2007.
C. Larutan Penyangga Bufer
Bufer dapat mencegah perubahan pH yang disebabkan oleh penambahan baik sedikit asam ataupun sedikit basa. Larutan bufer dapat dibuat dengan
mencampurkan asam lemah atau basa lemah dengan garamnya masing-masing. Ketahanan bufer dipengaruhi oleh pH larutan yang dibuat karena jika pH larutan
bufer sama dengan pKa asam atau basa yang membentuknya maka bufer dapat bekerja dengan baik Snyder Kirkland, and Dolan, 2010.
Menurut Snyder et al. 2010 terdapat beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam pemilihan bufer sebagai fase gerak pada KCKT, yaitu
kapasitas bufer, kelarutan komponen bufer, stabilitas bufer, dan serapan bufer pada daerah UV pada sistem KCKT. Kemampuan suatu bufer untuk
mempertahankan pH disebut sebagai kapasitas bufer. Hal ini dipengaruhi oleh nilai pKa asam atau basa lemah penyusun bufer, dan kapasitas bufer berada dalam
rentang pH±1,0 unit dari nilai pKa asam atau basa lemah penyusun bufer tersebut. Nilai pKa buffer fosfat adalah 2,1 dan kapasitas buffer fosfat dalam rentang
pH 1,1 –3,1 Kazakevich and Lobrutto, 2007. Menurut Kromidas 2005 nilai UV
cut-off bufer fosfat 50 mM dengan nilai pH = 2,0-3,0 adalah pada panjang
gelombang 210 nm.
D. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi KCKT merupakan salah satu metode analisis untuk pemisahan suatu campuran senyawa kimia. Pemisahan pada sistem
KCKT terjadi akibat adanya interaksi antara zat analit dengan fase diam dan fase gerak yang kemudian akan menghasilkan perbedaan waktu migrasi dari zat analit
Kazakevich and Lobrutto, 2007. Ada dua jenis KCKT dalam analisis, yaitu KCKT fase normal dan KCKT fase terbalik. KCKT fase normal menggunakan
fase diam bersifat lebih polar daripada fase geraknya, sedangkan KCKT fase terbalik menggunakan fase diam bersifat lebih non-polar daripada fase geraknya
Snyder et al., 2010. Salah satu keunggulan KCKT dibandingkan dengan kromatografi gas
yaitu dapat digunakan untuk menganalisis senyawa yang tidak menguap atau tidak tahan panas tanpa peruraian Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan
Republik Indonesia,
1995. Kelebihan
HPLC dibandingkan
metode PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
spektrofotometri yaitu pada sensitifitas dan selektivitas dalam kemampuan pemisahannya Ahuja dan Dong, 2005.
Instrumen KCKT terdiri atas kolom, detektor, wadah fase gerak, pompa, injector
, dan komputer atau perekam data Ahuja dan Dong, 2005. Salah satu
jenis kolom KCKT fase terbalik yang sering digunakan adalah tipe C
18
yang tersusun oleh suatu penyangga silika gel SiO
2
. Pada bagian permukaan silika terdapat gugus-gugus hidroksil -OH, sehingga silika gel relatif bersifat polar.
Silica gel dapat dimodifikasi dengan menutup gugus silanol dengan hidrokarbon rantai panjang untuk menghilangkan gugus hidroksil. Kebanyakan fase diam
dengan penyusun silica memiliki rentang pH yang dapat ditoleransi pada pH 2-7 Kazakevich and Lobrutto, 2007.
Detektor KCKT digolongkan menjadi dua golongan, yaitu golongan detektor universal dan golongan detektor spesifik. Beberapa karakteristik detektor
adalah memiliki respon yang cepat dan reprodusibel terhadap analit, memiliki sensitifitas tinggi, stabil dalam pengoperasiannya, dan sinyal yang dihasilkan
berbanding lurus dengan konsentrasi analit dalam sampel Gandjar dan Rohman, 2007. Detektor UV merupakan salah satu jenis detektor spesifik yang mendeteksi
analit secara spesifik sesuai panjang gelombang yang digunakan. Detektor UV dapat digunakan dalam sistem KCKT untuk senyawa-senyawa yang memiliki
serapan pada panjang gelombang 200-400 nm Snyder, Kirkland, and Glajch, 1997.
Fase gerak yang digunakan harus bersih, tidak berinteraksi dengan analit, dan tidak toksik. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur dan berpengaruh pada daya elusi dan resolusi. Pada KCKT, daya elusi dan resolusi ditentukan oleh polaritas seluruh pelarut, polaritas fase diam, dan
sifat komponen sampel. Komposisi fase gerak akan mempengaruhi pemisahan dan waktu retensi analit. Sebelum digunakan, fase gerak harus disaring terlebih dahulu
untuk menghilangkan partikel-partikel kecil. Adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, karena gas akan mengganggu analisis, terutama mengacaukan
bagian pompa dan detektor Rohman, 2009. Perlu diperhatikan agar nilai UV cut- off
fase gerak tidak mengganggu pembacaan hasil analit pada detektor UV. Nilai UV cut-off metanol adalah 205 nm Kazakevich and Lobrutto, 2007.
E. Validasi Metode Analisis
