pH dalam kolom dapat relatif stabil sehingga waktu retensi yang dihasilkan oleh senyawa asam askorbat menjadi reprodusibel selama tiga menit.
Fase gerak disaring terlebih dahulu menggunakan kertas saring Whatman dengan bantuan pompa vakum untuk menghilangkan partikel-partikel kecil yang
dapat menyumbat kolom, kemudian fase gerak didegassing dengan ultrasonicator untuk menghilangkan gelembung-gelembung udara yang dapat menggangu
pengukuran. Larutan metanol dan bufer fosfat masing-masing ditempatkan di dalam chamber fase gerak dengan kapasitas 500 mL.
B. Pembuatan Larutan Baku Asam Askorbat
Baku asam askorbat yang digunakan merupakan reference standard Supelco
dengan kemurnian 98,7. Larutan baku asam askorbat dibuat dengan cara melarutkan baku asam askorbat dalam metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3
40 : 60 yang berperan pula sebagai fase gerak dalam metode KCKT fase terbalik ini. Fase gerak yang digunakan bersifat polar karena sebagian besar terdiri dari
metanol dan air, sehingga dapat melarutkan asam askorbat yang bersifat polar pula, selain itu metanol dan 0,01 M bufer fosfat memenuhi syarat sebagai pelarut,
yaitu murni, dapat melarutkan asam askorbat dengan baik, tidak berinteraksi dengan analit, dan tidak toksik. Komposisi pelarut dan fase gerak yang digunakan
sama, sehingga dapat bercampur dan tidak membutuhkan waktu yang lama untuk membentuk puncak yang stabil.
Larutan baku asam askorbat dibuat dalam volume 10 mL untuk menghemat pelarut yang digunakan. Konsentrasi larutan stok asam askorbat yang
dibuat adalah sebesar 2000 µgmL, larutan intermediate 100 µgmL, larutan seri PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
baku 50; 75; 100; 125 dan 150 µgmL. Larutan seri baku digunakan dalam pembuatan kurva baku asam askorbat. Sebelum larutan seri baku dimasukkan ke
dalam vial dan diinjek ke sistem KCKT, larutan tersebut disaring terlebih dahulu menggunakan millipore untuk menghilangkan partikel-partikel kecil yang dapat
menyumbat kolom, dan didegassing untuk menghilangkan gelembung-gelembung udara yang dapat menggangu pengukuran.
C. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Asam Askorbat
Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan pada tiga konsentrasi yang berbeda, yaitu 40; 50 dan 60 µgmL menggunakan pelarut
campuran metanol : 0,01 M bufer fosfat pH 3 40 : 60. Penggunaan tiga level konsentrasi bertujuan untuk membuktikan bahwa perubahan konsentrasi sampai
batas tertentu tidak menyebabkan perubahan panjang gelombang maksimum dan dapat menunjukkan semakin besar konsentrasi yang diukur maka puncak spektra
yang dihasilkan semakin tinggi berbanding lurus. Spektra asam askorbat dapat dilihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Spektra penentuan panjang gelombang maksimum asam askorbat dalam pelarut campuran metanol : bufer fosfat 40 : 60 pH 3
Gambar 6. Gugus kromofor dan auksokrom asam askorbat
Pada Gambar 5 terjadi kenaikkan tinggi spektra seiring dengan kenaikkan
konsentrasi. Panjang gelombang maksimum asam askorbat menurut Moffat et al. 2011 adalah 243 nm, sedangkan pada pengukuran didapatkan panjang
gelombang maksimum adalah 244 nm. Asam askorbat dapat memberikan serapan di daerah UV karena senyawa ini memiliki gugus kromofor dan auksokrom
seperti pada Gambar 6. Menurut Farmakope Indonesia edisi V 2014, pergeseran panjang gelombang yang digunakan dalam rentang 1 nm dari panjang gelombang
teoritis yaitu di daerah 242-244 nm, sehingga panjang gelombang 244 nm dapat digunakan dalam pengukuran menggunakan KCKT fase terbalik.
D. Analisis Kualitatif Berdasarkan Waktu Retensi t
