E. Alat-alat Penelitian
Seperangkat spektrofotometer UV-Vis Perkin Elmer Lamda 20, pH-meter Metrohm 632, vacuum rotary evaporator Janke Kunkel,
timbangan elektrik BP 160 readability 0.10 mg, waterbath Emerson, mikropipet 200-1000 µL Acura 825, Socorex, tabung reaksi bertutup
Scott-Germany, hot plate Heidolph, freezer Toshiba, oven, maserator, termometer, corong pisah, blender, pengayak, software Minitab 7.1 trial
dan alat-alat gelas yang lazim digunakan untuk penelitian di laboratorium analisis Pyrex-Germany dan Iwaki.
F. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman jambu mete dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
dengan acuan Van Steenis 1981. 2.
Pembuatan dan penyiapan sampel daun jambu mete Tanaman jambu mete diperoleh dari Desa Wisata Karangtengah
Mojolegi, Imogiri, Bantul, Jogjakarta. Pengumpulan pada musim kemarau bulan Juni 2014. Pemanenan dilakukan pagi hari pukul 07.00 dengan
bahan yang dipakai adalah daun muda, yaitu pucuk daun dari ruas ketiga sampai ruas keenam pada tangkai daun. Bahan baku yang telah
dikumpulkan, dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti debu, tanah, kerikil, rumput, bagian tanaman yang tidak dibutuhkan ranting dan
bunga, bagian dari tanaman lain tangkai, daun, bunga dan biji inang,
bahan yang tidak dibutuhkan lainnya dan lain-lain. Daun jambu mete dicuci dengan cara dialiri dengan air sambil dibersihkan kotoran yang
melekat pada daun. Pencucian dilakukan sebanyak 3 kali. Daun jambu mete dirajang dengan ukuran seragam dengan panjang daun kurang lebih 1
cm. Daun jambu mete yang masih basah selanjutnya dikeringkan pada udara terbuka dan harus terlindung dari sinar matahari. Daun jambu mete
dihamparkan di atas kertas atau alas yang telah disiapkan dan diatur agar tidak terlalu menumpuk. Posisi daun harus sering dibalik sehingga
pengeringan dapat merata. Pengeringan berakhir ketika daun yang sedang dikeringkan mudah dipatahkan. Daun jambu mete yang telah kering
ditandai dengan mudah hancurnya daun ketika diremas dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu yang ikut serta ketika proses pengeringan terjadi
seperti tanah, kerikil, bahan yang rusak dan lain-lain tanpa pencucian. Daun jambu mete dibuat menjadi serbuk dengan bantuan alat penyerbuk,
yaitu blender, kemudian dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor mesh 40. Serbuk daun jambu mete kemudian disimpan dengan
membungkus serbuk menggunakan wadah kedap udara. Penyimpanan setelah dibungkus dilakukan di suhu ruangan.
3. Ekstraksi
Daun jambu mete yang telah menjadi serbuk diambil dari tempat penyimpanan dan ditimbang sebanyak 100,0 g lalu dimasukkan ke dalam
erlenmeyer 500 mL, ditambah dengan pelarut yang digunakan yaitu berupa etanol sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen.
Campuran yang telah homogen dimaserasi dengan bantuan orbital shaker pada suhu ruangan selama satu hari. Setelah satu hari campuran diambil
filtratnya melalui penyaringan dengan corong Buchner dengan bantuan pompa vakum. Maserasi tidak hanya dilakukan satu kali, tetapi dilakukan
berulang. Ampas hasil penyaringan selanjutnya dimaserasi dengan pelarut yang sama yaitu etanol, ampas ditambah etanol sampai terendam
sempurna dan dimaserasi hingga satu hari kemudian dilanjutkan dengan penyaringan menggunakan kertas saring dan bantuan corong Buchner dan
pompa vaccum. Proses maserasi dan penyaringan dilakukan berulang hingga filtrat yang diperoleh hampir tidak berwarna. Seluruh filtrat hasil
maserasi digabungkan menjadi satu. Pelarut yang masih ada pada filtrat diuapkan hingga volumenya berkurang menjadi sepersepuluh dari volume
awal. Diperoleh ekstrak kental daun jambu mete. 4.
Fraksinasi ekstrak etanol daun jambu mete
Ekstrak kental
yang didapatkan
kemudian difraksinasi
menggunakan ekstraksi cair – cair. Ekstrak kental dilarutkan dalam
akuades, kemudian difraksinasi menggunakan 100 mL etil asetat dengan perbandingan larutan air : etil asetat 1:1 vv. Akan terbentuk dua lapisan,
yaitu lapisan air dan lapisan etil asetat. Kedua lapisan dimasukan ke dalam erlenmeyer bertutup lalu dengan bantuan orbital shaker digojog hingga 24
jam. Lapisan etil asetat kemudian diambil dan ditampung dalam wadah. Lapisan air diekstraksi kembali menggunakan 100 mL etil asetat.
Fraksinasi ini diulang hingga 3 kali. Fraksi etil asetat kemudian dipekatkan
menggunakan vaccum rottary evaporator dimasukkan dalam cawan porselin yang sebelumnya telah ditimbang hingga bobot tetap. Cawan
berisi fraksi kental dimasukkan dalam oven hingga 24 jam. Fraksi kering yang didapat digunakan untuk analisis lebih lanjut.
5. Pembuatan reagen Fenton, Deoksiribosa, TCA, TBA, Pembanding,
dan Sampel a
Pembuatan reagen Fenton 1
Larutan FeCl
3
1 mM Timbang seksama lebih kurang 13,52 mg FeCl
3
.6H
2
O, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml dan dilarutkan dengan akuades
hingga tanda. Sebanyak 2,0 ml larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml. Selanjutnya diencerkan dengan
akuades hingga tanda. 2
Larutan EDTA 1mM EDTA ditimbang sebanyak 18,61 mg, dimasukkan ke dalam
gelas beaker dan dilarutkan menggunakan akuades. Larutan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, kemudian tambahkan aquades
hingga batas tanda. Ambil 2,0 mL larutan, masukkan ke dalam labu ukur 10 mL, tambahkan akuades hingga tanda.
3 Larutan vitamin C 1 mM
Vitamin C sebanyak lebih kurang 17,61 mg ditimbang secara seksama, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml dan dilarutkan hingga
tanda. Larutan vitamin C tersebut diambil kembali sebanyak 1,0 ml lalu dimasukan kedalam labu ukur 10 ml dan kemudian ditambahkan
akuades hingga mencapai tanda. 4
Larutan H
2
O
2
20 mM Sebanyak 0,091 ml larutan H
2
O
2
30 diambil dan dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml lalu dilanjutkan dengan
penambahan akuades hingga tanda. Dari larutan yang telah dibuat, diambil sebanyak 2,5 ml dan dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml,
kemudian encerkan hingga tanda dengan menggunakan akuades. b
Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM
Sebanyak lebih kurang 20,95 mg deoksiribosa ditimbang dengan seksama, lalu dilarutkan dengan akuades dalam labu ukur 10
ml hingga tanda. Dari larutan tersebut, diambil 4,0 ml dan diencerkan dalam labu ukur 25 ml dengan menggunakan akuades hingga batas
tanda. c
Pembuatan larutan TCA 5
Sebanyak 2,5 g TCA ditimbang dengan seksama dan dimasukkan kedalam beker glass 50 ml lalu ditambah dengan akuades
secukupnya. Larutan dipindahkan ke dalam labu ukur 50 ml dan ditambahkan akuades hingga tanda.
d Pembuatan larutan TBA 1
Sebanyak 0,25 g TBA ditimbang dengan seksama dan dimasukkan kedalam beker glass 100 ml lalu ditambahkan akuades
secukupnya, dilanjutkan dengan pemanasan diatas hot plate hingga seluruh TBA larut. Setelah itu, larutan TBA dipindahkan ke dalam
labu ukur 25 ml dan tambahkan akuades hingga tanda. e
Pembuatan larutan bufer fosfat Sebanyak 1,4196 g Na
2
HPO
4
ditimbang dengan seksama lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 500 ml dan dilarutkan dengan
akuades hingga tanda. Kemudian sebanyak 0,6805 g KH
2
PO
4
ditimbang secara seksama, lalu dilarutkan dengan akuades dalam labu ukur 250 ml hingga tanda. Selanjutnya larutan Na
2
HPO
4
dimasukkan secukupnya kedalam beker glass dan ditambahkan larutan KH
2
PO
4
yang telah dibuat sebelumnya, penambahan KH
2
PO
4
dilakukan dengan cara penetesan hingga tercapai pH 7,4 dengan bantuan pH
meter. f
Pembuatan larutan baku asam galat Sebanyak 10,0 mg asam galat ditimbang dengan seksama, lalu
ditambahkan 10,0 mL akuades : metanol p.a 1:1 sehingga diperoleh konsentrasi larutan asam galat sebesar 10
00,0 gmL. Diambil sebanyak 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 dan 0,8 mL larutan tersebut, kemudian
ditambahkan akuades : metanol p.a 1:1 sampai 10,0 mL, sehingga
diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat 40; 50; 60; 70; dan 80 gmL.
g Pembuatan larutan stok, intermediet kuersetin, dan larutan
pembanding Sebanyak 10,0 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a
dalam labu ukur 10, 0 mL sampai tanda sebagai larutan stok. Larutan intermediet dibuat dengan mengambil 1,0 mL larutan stok kuersetin
dan ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL dalam labu ukur 10 mL, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0
gmL. Pembuatan larutan pembanding dilakukan dengan mengambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL larutan kuersetin konsentrasi
100,0 gmL, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5,0;
7,5; 10,0; 12,5; dan 15,0 gmL.
h Preparasi larutan uji fraksi etil asetat
1. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total
Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan 10,0 mL metanol p.a dalam labu ukur 10 mL sehingga
diperoleh kons entrasi sebesar 1000,0 gmL. Kemudian larutan
tersebut diambil 1,0 mL dan dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL ditambahkan metanol p.a hingga batas sehingga diperoleh konsentrasi
larutan uji sebesar 100,0 gmL.
2. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan
Sejumlah 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL lalu ditambahkan metanol p.a
sampai batas sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan mengambil 5,0 mL stok larutan uji kemudian
dimasukkan kedalam labu ukur 50 mL lalu ditambahkan metanol p.a sampai batas, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar
10 0,0 gmL. Diambil sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 mL larutan
tersebut, kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL lalu ditambahkan metanol p.a sampai batas tanda, sehingga diperoleh
konsentrasi larutan uji sebesar 10,0; 20,0; 30,0; 40,0; 50,0 gmL.
6. Uji pendahuluan
a. Uji keberadaan senyawa fenolik
Larutan uji dengan konsentrasi 5 00,0 gmL dan larutan
pembanding asam galat 150,0 gmL diambil sebanyak 0,5 mL kemudian ditambahkan 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang
telah diencerkan dengan akuades 1:10 vv ke dalam tabung reaksi lalu didiamkan selama 10 menit. Larutan natrium karbonat 1 M
ditambahkan sebanyak 2,0 mL, kemudian amati warna larutan tersebut. Bandingkan dengan warna larutan yang berisi air : metanol
1:1 + pereaksi, fraksi etil asetat dan asam galat tanpa diberi pereaksi.
b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan
Dalam 2 tabung reaksi, dimasukkan larutan uji fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete sebanyak 1000 µ l dengan
konsentrasi sebesar 50,0 gmL. Sebagai kontrol negatif, dimasukkan
metanol pa kedalam tabung sebesar 1000 µ l. Sebagai kontrol positif selanjutnya dimasukkan 1000 µ l larutan standar kuersetin dengan
konsentrasi sebesar 15,0 gmL kedalam tabung. Selanjutnya masing-
masing tabung dipanaskan dalam waterbath dengan suhu tidak lebih dari 60°C hingga seluruh metanol menguap. Kemudian pada masing-
masing tabung ditambahkan 3400 µ l buffer fosfat pH 7,4, 600 µ l larutan deoksiribosa 2,5 mM, 500 µ l FeCl
3
1 mM, 500 µl EDTA 1 mM, 500 µ l H
2
O
2
20 mM, dan 500 µ l asam askorbat 1 mM sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml. Selanjutnya campuran
diinkubasikan pada temperatur 37°C selama 60 menit. Setelah inkubasi lalu campuran ditambahkan 1 ml TCA 5 dan 1 ml TBA
1. Campuran yang ada kemudian dipanaskan diatas waterbath selama 30 menit dengan temperatur 80°C. Setelah dipanaskan,
dilakukkan pendinginan selama 5 menit di bawah air mengalir. Ketiga kontrol dibandingkan satu sama lainnya.
7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total
a. Penentuan operating time OT
Seba nyak 0,5 mL larutan asam galat 40; 60; dan 80 gmL
ditambahkan dengan 2,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah
diencerkan dengan akuades 1:10 vv, kemudian larutan didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit larutan selanjutnya ditambahkan
dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang
gelombang 750 nm selama 60 menit. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 100 gmL dengan waktu pengamatan selama 60 menit.
b. Penentuan panjang gelombang maksimum
maks
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 40; 50; dan 6 0 gmL
ditambahkan dengan 2,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air 1:10 vv , kemudian larutan didiamkan
selama 5 menit. Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama operating time, dibaca
panjang gelombang
pada absorbansi
maksimum dengan
spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800 nm. 8.
Penetapan kandungan fenolik total a.
Pembuatan kurva baku asam galat
Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 40; 50; 60; 70; dan 8 0 gmL
ditambah dengan 2,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades 1:10 vv , kemudian larutan didiamkan
selama 5 menit. Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah menunggu selama operating time,
absorbansinya dibaca pada panjang gelombang maksimum yang telah
didapat terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a 1:1, reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Dilakukkan
replikasi pengerjaan sebanyak tiga kali. b.
Estimasi kandungan fenolik total larutan uji Diambil 0,5 mL larutan uji 100 gmL, lalu dilanjutkan
sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai mg ekuivalen asam galat
per g fraksi etil asetat. Dilakukan tiga kali replikasi. 9.
Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a.
Penentuan operating time OT
Sebanyak 300 µL larutan deoksiribosa 2,5 mM dimasukkan kedalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 300 µl FeCl
3
1 mM, 300 µ l EDTA 1 mM, 300 µ l H
2
O
2
20 mM, 4200 µ l buffer fosfat pH 7,4 dan 300 µ l asam askorbat 1 mM. Larutan yang telah tercampur
selanjutnya diinkubasikan selama 60 menit pada temperatur 37°C, setelah inkubasi dilakukan penambahan 1 ml TCA 5 dan 1 ml TBA
1. Campuran yang ada kemudian dipanaskan diatas waterbath selama 30 menit dengan temperatur 80°C. Tabung reaksi diangkat
setelah 30 menit dan didinginkan dengan bantuan air mengalir selama 5 menit. Dilakukan pembacaan absorbansi dengan panjang gelombang
maksimum teoritis sebesar 532 nm selama 1 jam.
b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
maks
Masukkan berturut-turut 200, 300, dan 400 µ l larutan deoksiribosa 2,5 mM pada tabung reaksi tertutup, pada setiap tabung kemudian
diberikan 300 µ l FeCl
3
1 mM, 300 µ l EDTA 1 mM, 300 µ l H
2
O
2
20 mM, 4200 µ l buffer fosfat pH 7,4 dan 300 µ l asam askorbat 1 mM
penambahan buffer fosfat disesuaikan dengan volume deoksiribosa sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml. Selanjutnya campuran
diinkubasikan selama 60 menit pada temperatur 37°C, setelah inkubasi dilakukan penambahan 1 ml TCA 5 dan 1 ml TBA 1.
Campuran yang ada kemudian dipanaskan diatas waterbath selama 30 menit dengan temperatur 80°C. Larutan didinginkan dengan bantuan
air mengalir selama 5 menit. Dilakukkan scanning absorbansi pada panjang gelombang 400-600 nm.
10. Uji aktivitas antioksidan
Dalam 11 tabung reaksi, dimasukkan larutan uji fraksi etil asetat ekstrak etanol jambu mete sebanyak 1000 µ l dengan konsentrasi
sebesar 10,0; 20,0; 30,0; 40,0; 50,0 gmL. Sebagai kontrol negatif,
dimasukkan metanol pa kedalam tabung sebesar 1000 µl. Sebagai kontrol positif selanjutnya dimasukkan 1000 µ l larutan standar
kuersetin dengan konsentrasi sebesar 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; dan 15,0 gmL kedalam 5 tabung lainnya. Selanjutnya masing-masing tabung
dipanaskan dalam waterbath dengan suhu tidak lebih dari 60°C hingga
seluruh metanol menguap. Kemudian pada masing-masing tabung ditambahkan 3400 µ l buffer fosfat pH 7,4, 600 µl larutan deoksiribosa
2,5 mM, 500 µ l FeCl
3
1 mM, 500 µ l EDTA 1 mM, 500 µ l H
2
O
2
20 mM, dan 500 µ l asam askorbat 1 mM sehingga volume akhir
campuran adalah 6 ml. Selanjutnya campuran diinkubasikan pada temperatur 37°C selama 60 menit. Setelah inkubasi lalu campuran
ditambahkan 1 ml TCA 5 dan 1 ml TBA 1. Campuran yang ada kemudian dipanaskan diatas waterbath selama 30 menit dengan
temperatur 80°C. Setelah dipanaskan, dilakukkan pendinginan dan dibaca absorbansinya pada daerah operating time dan panjang
gelombang maksimum yang didapatkan dari hasil pengukuran sebelumnya. Hasil absorbansi yang didapat dapat digunakan untuk
menghitung inhibiton concentration IC dan dibuat persamaan regresi linier yang merupakan hubungan antara konsentrasi fraksi etil
asetat vs IC.
G. Analisis Hasil
Kategori