UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Selanjutnya, ekstrak kental 14 gram digerus dengan silika gel 12 gram sehingga diperoleh ekstrak kering, kemudian ekstrak
tersebut dimasukkan perlahan ke dalam kolom. Setelah kolom siap, maka eluen dimasukkan perlahan-lahan dimulai dari n-heksan 100
dan ditingkatkan kepolarannya menjadi n-heksan : etil asetat = 9:1 hingga etil setat 100 kemudian dilanjutkan dengan perbandingan
etil asetat : metanol = 9:1 hingga metanol 100. Adapun jumlah pelarut yang digunakan yakni 100 mL untuk tiap perbandingan.
Hasil pemisahan ditampung dalam botol vial, masing-masing 5 mL dan diberi nomor. Kemudian masing-masing fraksi pada vial
diuji dengan KLT untuk mengetahui botol vial yang memiliki bercak yang sama. Fraksi yang menampakkan bercak yang sama
dikumpulkan dan disatukan dalam 1 vial. Kemudian pada kromatografi kolom kedua, silika gel yang
digunakan sebanyak 15 gram yang dibuat bubur silika dan dilakukan penyiapan kolom kedua seperti kolom pertama. Sebanyak 0,6 gram
fraksi D dimasukkan ke dalam kolom yang telah berisi bubur silika yang telah dimampatkan, kemudian dialiri eluen n-heksan 100
hingga hasil isolasi yang ditampung dalam vial berwarna bening. Kemudian dilanjutkan dengan eluen n-heksan:etil asetat=9:1 hingga
hasil isolasi yang ditampung dalam vial berwarna bening. Kemudian dilanjutkan dengan eluen n-heksan:etil asetat = 8:2 hingga eluen n-
heksan:etil asetat = 4:6 hingga hasil isolasi yang ditampung dalam vial berwarna bening. Setelah itu, kolom dibilas dengan
menggunakan etil asetat 100 sebanyak 120 mL. Hasil pemisahan ditampung dalam botol vial, masing-masing
5 mL dan diberi nomor. Kemudian masing-masing fraksi pada vial diuji dengan KLT untuk mengetahui botol vial yang memiliki bercak
yang sama. Fraksi yang menampakkan bercak yang sama dikumpulkan dan disatukan dalam 1 vial.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
b. Pengujian dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Plat silika gel 60 F
254
dibuat dengan ukuran lebar 5 cm dan panjang 5 cm dan diberi garis batas awal dan batas akhir elusi 0,5
cm. Chamber dijenuhkan terlebih dahulu dengan eluen yang akan digunakan, untuk memilih eluen yang optimal dilakukan percobaan
terhadap beberapa komposisi dengan perbandingan bertingkat dari eluen yang digunakan. Dimulai dengan percobaan n-heksan 100 ,
jika tidak terjadi pemisahan maka perbandingan eluen ditingkatkan menjadi n-heksan : etil asetat = 4:1, jika masih tidak terjadi
pemisahan maka dinaikkan perbandingannya menjadi 3:2 dan 2:3. Volume eluen yang digunakan yakni 5 mL.
Ekstrak dan fraksi yang akan diuji dilarutkan dalam pelarut, kemudian ditotolkan pada garis batas awal elusi lalu dikeringkan.
Setelah totolan mengering, plat KLT ditempatkan dalam sebuah chamber yang telah dijenuhkan, kemudian chamber ditutup rapat.
Setelah eluen mencapai garis akhir elusi, plat KLT dikeluarkan dan dikeringkan.
Bercak yang dihasilkan diamati di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm. Untuk menampakkan
bercak yang tidak berwarna dan tidak berfluorosensi dapat diamati dengan penambahan pereaksi godyns reagen A : 1 vanilin dalam
etanol 70 dan 3 asam perklorat dalam aquades = 1:1, reagen B : H
2
SO
4
1 yang dilanjutkan dengan pemanasan. Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah dari
lapisan tipis menggunakan harga Rf. Harga Rf Retardation factor didefinisikan sebagai berikut Sastrohamidjojo, 1985 :
Rf = Nilai Rf yang diperoleh dibandingkan dengan literatur, untuk
mengetahui kemungkinan senyawa hasil pemisahan dengan KLT.
c. Rekristalisasi
Untuk senyawa berbentuk kristal dilakukan pemurnian dengan rekristalisasi, yaitu melarutkan senyawa dengan pelarut atau
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
campuran pelarut yang cocok. Pelarut yang digunakan dipilih berdasarkan kemampuan melarutkan zat yang akan dimurnikan.
Adanya perbedaan kelarutan akibat penambahan pelarut lain akan menyebabkan senyawa utama akan mengkristal lebih dahulu. Kristal
direkristalisasi dengan pelarut n-heksan dan metanol sehingga pengotornya hilang dan diperoleh kristal yang berwarna putih jernih
berbentuk jarum.
3.3.6. Uji Kemurnian Senyawa
a. Uji Titik Leleh
Sampel dibuat dengan memasukkan kristal ke ujung pipa kapiler yang nanti akan dimasukkan ke alat pengukur melting point.
Kemudian dilakukan pengamatan rentang suhu ketika kristal melebur mulai dari awal melebur hingga melebur sempurna.
b. Uji Panjang Gelombang Maksimum
Larutan induk konsentrasi 100 ppm dibuat dengan melarutkan kristal 1 mg dalam n-heksan 10 mL kemudian
diencerkan menjadi 50 ppm dengan mengencerkan 5 mL larutan induk dalam labu ukur dengan n-heksan 10 mL. Alat
Spektrofotometri UV-Vis diatur panjang gelombang deteksinya pada 200 hingga 800 nm. Pengukuran dilakukan pertama terhadap blanko
berupa pelarut n-heksan kemudian dilanjutkan dengan pengukuran terhadap sampel. Kemudian dilakukan pengamatan terhadap
terbentuknya peak yang menunjukkan panjang gelombang maksimum dari senyawa tersebut.
c. Uji Kemurnian dengan High Perfomance Liquid Chromatography
HPLC Sampel dibuat dengan melarutkan 2 mg kristal dalam
kloroform pro-analisis 5 mL untuk konsentrasi 400 ppm. Kolom fase diam yang digunakan adalah C18 panjang 15 cm, diameter 4,6 mm,
dan ukuran partikel 5 µm. Fase gerak yang digunakan adalah asetonitril : metanol = 70: 30. Panjang gelombang deteksi diatur
pada 206 dan 220 nm, laju alir 1 mLmenit, suhu 25 C, waktu
