Gambar 2. Kamar Hitung Improved Neubauer Zaneveld et al., 1977
3.7.2 Uji Histopatologi
Perubahan histopatologi akibat yang ditimbulkan virus VNN terhadap organ otak ikan uji dilihat dengan cara pembuatan preparatslide jaringan kontrol dan perlakuan.
Menurut Suntoro 1983, dengan metode parafin adalah fiksasi, pencucian washing, dehidrasi, penjernihan clearing, infiltrasi parafin, penanaman embedding,
pemotongan sectioning, penempelan affiksing, deparafinasi, pewarnaan staining, penutupan dan pemberian label mounting and labelling.
Sampel organ otak yang telah dicuci dengan larutan NaCl 0,95. Kemudian sampel dimasukkan ke dalam larutan fiksatif Buffer Neutral Formalin BNF 10
selama 2 - 10 jam tergantung dari macam jaringan dan tebaltipisnya jaringan. Setelah otak difiksasi, otak dicuci washing dengan menggunakan alkohol 70 yang berguna
untuk menghilangkan larutan fiksasi dari jaringan. Proses dehidrasi, otak dimasukkan ke dalam alkohol secara bertahap, dengan alkohol 30, 50, 60, 70, 80, 90, 96 dan
alkohol absolut masing-masing selama 1 jam. Botol yang berisi otak tersebut digoyang-goyangkan terus menerus shaker agar proses dehidrasinya lebih cepat.
Setelah dehidrasi, segera dilakukan proses penjernihan clearing, dengan menggunakan perbandingan alkohol:xylol yaitu dengan perbandingan 1:3, 1:1, 3:1
masing-masing 1 jam, berakhir di xylol murni. Proses infiltrasi parafin seluruhnya dikerjakan di dalam oven dengan suhu 56-60
C, menggunakan perbandingan xylol:parafin 3:1, 1:1, 1:3 dan berakhir di parafin murni masing-masing selama 1 jam.
Proses ini dimaksudkan untuk menghindari perubahan lingkungan yang sangat
Universitas Sumatera Utara
mendadak terhadap jaringan tersebut. Sebelum melakukan penanaman embedding, otak dimasukkan ke dalam parafin cair yang mempunyai titik cair yang sama dengan
parafin yang digunakan untuk infiltrasi selanjutnya kotak-kotak karton yang disediakan untuk tempat penanaman, ukurannya sesuai dengan besarkecil jaringan.
Parafin cair dituang ke dalam kotak tersebut, lalu otak diambil dengan pinset dan diletakkan ke dalam kotak yang telah berisi parafin tadi, selanjutnya parafin dibiarkan
hingga menjadi keras blok parafin. Setelah terbentuk blok parafin, blok tersebut ditempeldilekatkan pada holder yang terbuat dari kayu yang berbentuk persegi.
Penyatan blok parafin dilakukan dengan menggunakan mikrotom putar. Biasanya untuk jaringan hewan pada umumnya tebal irisan adalah 6 ยต m. Penyayatan
dari blok parafin akan diperoleh berupa pita-pita parafin. Pita parafin yang diperoleh kemudian ditempatkan pada gelas benda yang telah ditetesi albumin-meyer.
Selanjutnya pita parafin ditetesi beberapa tetes akuades agar pita parafin merentang. Gelas benda diletakkan pada hot-plate, dan dibiarkan hingga kering. Proses
penempelan affiksing ini telah selesai dan dapat dimulai dengan pewarnaan staining. Deparinasi dilakukan dengan gelas benda yang telah berisi irisan jaringan
tadi direndam ke dalam xylol sekurang-kurangnya 15 menit. Selanjutnya jaringan dicelupkan ke dalam alkohol absolut, 96, 80, 70, 50, 30 dan akuades masing-masing
selama 1 menit. Jaringan dimasukkan ke dalam larutan Hematoxylin-Eosin Ehrlich selama 3 - 7 detik selanjutnya jaringan dicuci dengan air mengalir selama 10 menit,
lalu jaringan dicuci dengan akuades. Jaringan dimasukkan ke dalam larutan pewarna eosin 0,5 dalam alkohol 70 selama 1 - 3 menit, preparat jaringan dimasukkkan
berturut-turut ke dalam alkohol 60, 70, 80, 90, 96, dan alkohol absolut, selama 1 menit. Selanjutnya preparat dimasukkan ke dalam xylol selama 10 menit. Preparat
diangkat dari xylol dan diolesi dengan Canada balsam, yang selanjutnya jaringan ditutup dengan gelas penutup. Sediaan histologis diberi label dan ditulis nama
jaringan, potongan, pewarnaan yang digunakan ataupun tanggal pembuatan, kemudian diamati di bawah mikroskop.
Universitas Sumatera Utara
3.7.3 Uji Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction RT-PCR
Kategori