3.7.3 Uji Reverse Transcriptase Polimerase Chain Reaction RT-PCR
Sampel ikan 20 mg sampel otak, atau 20 mg sampel mata dimasukkan ke dalam tabung mikro 1,5 ml kemudian sampel dilarutkan dengan 500
µl RNA Extraction Solution. Sampel digerus sampai hancur, diamkan pada suhu kamar selama
5 menit. Sampel ditambahkan 100 µl CHCl
3
, kemudian vortex 20 detik. Sampel dibiarkan pada suhu kamar selama 2 - 3 menit, lalu sentrifugasi pada 12000 rpm
selama 15 menit. Sampel dipipet 200 µl dari fase atas bagian jernih ke dalam tabung
mikro 0,5 ml dengan 200 µl 2-propanol isopropanol, IPA. Vortex sebentar, lalu
sampel disentrifugasi pada 12000 rpm selama 10 menit, isopropanol tersebut dibuang. Sampel dicuci dengan 0,5 ml etanol 75, kemudian spin down 9000 rpm selama 5
menit untuk mendapatkan pelet RNA, kemudian tuang etanol dan pelet dikeringkan. Pelet dilarutkan dengan 200
µl air DEPC dd H
2
O.
Amplikasi dilakukan dengan menyiapkan campuran RT-PCR dan Nested PCR dibutuhkan sesuai jumlah sampel. Untuk setiap campuran reaksi, perlu
mempertimbangkan 3 standar positif 10
3
, 10
2
dan 10
1
dan 1 kontrol negatif ddH
2
O atau ragi tRNA. Pipet 8
µl campuran reaksi reagen RT-PCR ke masing-masing tabung reaksi 0,2 ml. Masing-masing campuran reaksi ditambahkan 2
µl ekstrak sampel RNA atau standar, lalu dimasukkan ke dalam thermal cycle untuk proses
amplikasi tahap 1 RT-PCR. Setelah tahap 1 selesai, reagen Nested PCR ditambahkan sebanyak 15
µl untuk setiap tabung, lalu dilakukan proses amplikasi tahap 2 Nested PCR. Setelah selesai, Nested PCR tambahkan 5
µl 6X loading dye untuk masing-masing tabung reaksi dan aduk rata. Setelah pencampuran, sampel siap
untuk elektroforesis.
Gel agarose 2 2 gram agarose dilarutkan dengan 100 ml TAE 1x dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Larutan dipanaskan menggunakan microwave,
sampai mendidih dan berubah menjadi bening. Gel agarose didinginkan pada temperatur kamar sampai temperatur sekitar 50
o
C dan perlahan-lahan gel dituangkan ke dalam kotak gel dengan ketinggian gel agarose sekitar 0,5 - 0,3 cm, dan total
ketebalan disarankan untuk tidak lebih besar dari 0,8 cm. Sisir plastik blocker
Universitas Sumatera Utara
dimasukkan ke dalam gel agarose. Blocker diangkat pada kedua sisi kotak gel saat gel agarose di dalam benar-benar memadat, kemudian dapat dilakukan proses
elektroforesis. Buffer elektroforesis 1X dimasukkan ke dalam kotak gel sampai tuas penyangga hanya menutupi gel. Sampel ditambahkan 8
µl ke dalam sumur satu per satu. Marker dimasukkan ke sumur pertama sebanyak 5
µl, dan kontrol negatif ke sumur kedua, diikuti dengan sampel dan terakhir kontrol positif IQ 2000, 2003.
Running pada tegangan 100 - 150 Volt. Elektroforesis dihentikan bila warna biru gelap mendekati 12 untuk 23 dari gel. Kemudian, gel dikeluarkan dari kotak gel
untuk mempersiapkan prosedur EtBr pewarnaan.
Pewarnaan dilakukan dengan memasukkan 10 µl Ethidium Bromida EtBr ke
dalam 100 ml akuades. Agarose hasil elektroforesis direndam dengan larutan EtBr ke dalam wadah plastik selama 10 menit dan sesekali digoyang. Agarose dikeluarkan
dan dicuci dengan akuades steril di dalam wadah plastik selama 10 menit. Gel diletakkan pada pertengahan transilluminator gelombang UV untuk membaca akhir
hasil.
3.8 Analisis Data
Kategori