diletakkan pada tempat yang tersedia, kemudian tombol start ditekan dan akan diperoleh nilai L, a, dan b dari sampel.
Hasil pengukuran dikonversi ke dalam sistem Hunter dengan L menyatakan parameter kecerahan dari hitam 0 sampai putih 100. Notasi a menyatakan
warna kromatik campuran merah-hijau dengan nilai + a positif dari 0 sampai +100 untuk warna merah dan nilai
– a negatif dari 0 sampai -80 untuk warna hijau. Notasi b menyatakan warna kromatik campuran biru-kuning dengan nilai +
positif dari 0 sampai +70 untuk warna kuning dan nilai –b negatif dari 0
sampai -80 untuk warna biru, sedangkan L menyatakan kecerahan warna, selanjutnya
dari nilai a dan b dapat dihitung ˚Hue yang menunjukkan kisaran warna sampel. Hubungan antara ˚Hue dan warna sampel dapat dilihat pada Tabel
5. Ni lai ˚Hue dapat dihitung dengan persamaan :
˚Hue = tan-1 Tabel 5. Hubungan ˚Hue dengan warna sampel
˚Hue Warna Sampel
18˚- 54˚ red R
54˚- 90˚ yellow red YR
90˚-126˚ yellow Y
126˚-162˚ yellow green YG
162˚-198˚ green G
198˚-234˚ blue green BG
234˚-270˚ blue B
270˚-306˚ blue purple BP
306˚-342˚ purple P
342˚- 18˚ red purple RP
3.4.7 Analisis asam amino AOAC 1995
Komposisi asam amino ditentukan dengan High Performance Liquid Chromatography HPLC. Sebelum digunakan, perangkat HPLC harus dibilas
dulu dengan eluen yang akan digunakan selama 2-3 jam. Begitu pula dengan syringe yang akan digunakan juga harus dibilas dengan akuades. Analisis asam
amino menggunakan HPLC terdiri atas 4 tahap, yaitu 1 tahap pembuatan hidrolisat protein; 2 tahap pengeringan; 3 tahap derivatisasi; dan 4 tahap
injeksi serta analisis asam amino. Khusus untuk pengujian asam amino bebas, tidak dilakukan proses hidrolisis dengan asam dan pemanasan.
a Tahap pembuatan hidrolisat protein
Tahap preparasi contoh adalah pembuatan hidrolisat protein. Prosedurnya sebagai berikut: contoh ditimbang sebanyak 0,2 g dan dihancurkan. Contoh yang
telah hancur ditambahkan dengan HCl 6 N sebanyak 5-10 mL, kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 100ºC selama 24 jam. Hal ini dilakukan untuk
menghilangkan gas atau udara yang ada pada contoh agar tidak mengganggu kromatogram yang dihasilkan, selain itu pemanasan dilakukan untuk
mempercepat reaksi hidrolisis. Setelah pemanasan selesai, hidrolisat protein disaring dengan milipore berukuran 45 mikron.
b Tahap pengeringan
Hasil saringan diambil sebanyak 30 μL larutan pengering. Larutan pengering dibuat dari campuran antara metanol, natrium asetat, dan trietilamim
dengan perbandingan 2:2:1. Setelah ditambahkan dengan larutan pengering, dilakukan pengeringan dengan gas nitrogen untuk mempercepat pengeringan dan
mencegah oksidasi.
c Tahap derivatisasi
Sebanyak 30 μL larutan derivatisasi ditambahkan pada hasil pengeringan. Larutan derivatisasi dibuat dari campuran antara larutan metanol, pikoiotisianat,
dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4. Proses derivatisasi dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada contoh, kemudian
dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan 10 mL asetonitil 60 atau buffer fosfat 0,1 M lalu dibiarkan selama 20 menit. Hasil pengenceran disaring
kembali menggunakan milipor berukuran 0,45 mikron.
d Injeksi ke HPLC
Hasil saringan diambil sebanyak 20 μL untuk diinjeksikan ke dalam HPLC. Penghitungan konsentrasi asam amino dilakukan dengan cara membandingkan
kromatogram contoh dengan standar, pembuatan kromatogram standar menggunakan asam amino yang mengalami perlakuan yang sama dengan contoh.
Kandungan masing-masing asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus:
