27
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental karena subjek uji diberi perlakuan selama proses penelitian .
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah konsentrasi dari rutin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik herba selada air .
2. Variabel terikat
Varibel terikat pada penelitian ini adalah nilai IC.
3. Variabel pengacau terkendali
Varibel pengacau terkendali pada penelitian ini adalah tempat tumbuh tanaman selada air.
4. Variabel pengacau tak terkendali
Varibel pengacau tak terkendali pada penelitian ini adalah usia tanaman dan kondisi tanah.
C. Definsi Operasional
1. Herba selada air
Herba selada air diperoleh dari perkebunan di Kaliurang, Yogyakarta. Sayuran didapatkan dari pemasok sayuran segar yaitu dari depo sayur segar.
Herba selada air yang diguankan dalam penelitian ini adalah keseluruhan herba selada air yang meliputi daun dan batang kecuali akar.
2. Ekstrak etanolik herba selada air
Ekstrak etanolik herba selada air adalah ekstrak kental yang diperoleh dari serbuk selada air dengan menggunakan pelarut etanol teknis 70 dengan
metode maserasi. Ekstrak kental didapatkan dengan menggunakan vaccum rotary evaporator
.
3. Fraksi etil asetat dari herba selada air.
Fraksi etil asetat herba selada air adalah ekstrak kental yang diperoleh dari ekstrak kental etanolik yang sudah melalui proses farksinasi. Ekstrak kental
dari fraksi etil asetat dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator .
4. Persen IC.
Persen IC merupakan kemampuan penangkapan fraksi etil asetat untuk menangkap radikal bebas yang diperoleh dari nilai absorbansi.
5. IC
50
IC
50
merupakan besarnya konsentasi senyawa sampel yang mampu menurunkan absorbansi DPPH sebanyak 50.
D. Alat dan Bahan
Pada penelitian ini alat dan bahan yang digunakan adalah sebagai berikut:
1. Alat
Alat –alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-1240,
Seperangkat alat –alat gelas dari pyrex, kuvet, vaccum rotary evaporator Junke
Kunkle, neraca analitik Scaltec SBC 22, BP 160P, waterbath labo- tech ,Heraeus, blender, oven, printer.
2. Bahan
Bahan-bahan yang diguankan adalah serbuk herba selada air, etanol 70 kualitas farmasetis, wasbensin, etil asetat dari P.T Brataco, rutin, DPPH,
reagen Folin-Ciocalteu diperoleh dari Sigma.Chem, metanol p.a. diperoleh dari E. Merck, natrium karbonat, aquadest yang didapat dari laboratorium
Farmakognosi-Fitokimia.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman pada penelitian ini dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
2. Pengumpulan bahan
Pengumpulan bahan dilakukan di Kaliurang pada pagi hari, kemudian sampel herba selada air segera dibawa ke laboratorium untuk dikeringkan karena
jika terlalu lama akan terjadi browning. Pemanenan dilakukan pada bulan Februari 2013.
3. Preparasi sampel
Sampel segar berupa herba selada air sebanyak 4,3 kg dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 40
C selama 2 hari. Setelah itu herba yang sudah kering digiling dengan blender sampai terbentuk serbuk yang halus. Serbuk
kemudian dimaserasi dengan menggunakan pelarut etanol 70 selama dua hari . Setelah itu memisahkan ampas dengan pelarut menggunakan corong Buchner.
Ampas sisa kemudian diremaserasi selama dua hari. Setelah itu dipisahkan antara pelarut dan ampas dengan menggunakan corong Buchner, kemudian
mencampurkan antara pelarut satu dan dua yang diperoleh dari hasil maserasi yang pertama dan hasil remasearsi dan dipekatkan menggunakan vaccum rotary
evaporator sampai diperoleh ekstrak kental etanolik. Ekstrak kental etanolik yang
diperoleh kemudian dilarutkan dengan menggunakan aquades hangat sebanyak 300 ml, kemudian dipartisi dengan menggunakan wasbensin, fase wasbensin
dibuang dan diambil fase air. Setelah itu fase air dipartisi lagi dengan menggunakan etil asetat, sehingga didapatkan fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat
yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan menggunakan vacum rotary evaporator
sampai diperoleh ekstrak kental fraksi etil asetat. Fraksi inilah yang akan digunakan untuk penelitian lebih lanjut.
4. Penetapan kandungan fenolik total
Kandungan fenolik total ditentukan dengan menggunakan metode spektrofotomteri.
a. Pembuatan kurva baku asam galat Sebanyak 0,5 ml larutan asam galat 50, 75, 100, 125 dan 150 µgml
ditambahkan dengan 5 ml larutan reagen Folin- Ciocalteu yang telah diencerkan dengan menggunakan aquadest dengan perbandingan 1:10 kemudian
ditambahkan dengan 4,0 ml larutan Na
2
CO
3
1M. Setelah 30 menit, absorbansinya dibaca pada panjang gelombang 760 nm.
b. Optimasi penetapan kandungan fenolik total 1 Penentuan OT Operating Time
Sebanyak 0,5 ml larutan induk asam galat 50, 100 dan 150 µgml ditambahkan dengan 5,0 ml reagen Folin-Ciocalteu yang telah
diencerkan dengan aquadest 1:10 dan kemudian ditambahkan dengan 4,0 ml larutan Na
2
CO
3
1M. Absorbansi diukur setiap 5 menit pada panjang gelombang 760 nm selama 40 menit.
2 Penentuan panjang gelombang maksimum Sebanyak 0,5 ml larutan asam galat 50, 100 dan 150 µgml ditambahkan
dengan 5,0 ml larutan reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan aquadest dengan perbandingan 1:10 kemudian ditambahkan
dengan 4,0 ml larutan Na
2
CO
3
1 M selanjutnya dilakukan scanning pada panjang gelombang 600- 800 nm.
c. Estimasi penetapan kadar senyawa fenolik total sampel Sebanyak 0,5 ml larutan sampel dengan kosentrasi 500 µgml
ditambhakan dengan 5,0 ml reagen Folin- Ciocalteu yang telah diencerkan dengan aquadest dengan perbandingan 1:10 dan kemudian ditambahkan dengan
4,0 ml larutan Na
2
CO
3
1M , diamkan selama 30 menit dan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang maksimum 448,6 nm. Kandungan fenolik total
dinyatakan sebagai massa ekivalen asam galat mg ekivalen asam galat per g fraksi etil asetat.
5. Pembuatan larutan DPPH, pembanding dan uji aktivitas antioksidan
a. Pembuatan larutan DPPH Sejumlah tertentu DPPH dilarutkan dengan menggunakan metanol p.a.
pada labu ukur 10 ml sehingga didapatkan konsentrasi larutan DPPH sebesar 0,4 mM.
b. Pembuatan larutan pembanding 1 Pembuatan larutan induk rutin
Sebanyak 2,5 mg rutin ditimbang dan kemudian dilarutkan metanol p.a pada labu ukur 10 ml, sehingga didapatkan konsentrasi larutan induk
sebesar 250 µgml. 2 Pembuatan larutan stok
Dari larutan induk diambil sebanyak 0,6 ml, 0,7 ml, 0,8 ml, 0,9 ml dan 1,0 ml dan kemudian dilarutkan dengan metanol p.a. sehingga diperoleh
kadar sebesar 15 µgml, 17,5 µgml, 20 µgml, 22,5 µgml dan 25 µgml. c. Pembuatan larutan uji
Ditimbang 20 mg sampel kemudian dilarutkan dengan menggunakan metanol p.a. dalam labu ukur 10 ml sampai batas tanda. Dari larutan induk
kemudian diambil sebanyak 1,75 ml, 1,875 ml, 2,0 ml, 2,125 ml dan 2,25 ml ,
sehingga didapatkan kadar seri larutan uji sebesar 350 µgml, 375 µgml , 400 µgml, 425 µgml, 450 µgml.
6. Penentuan Operating Time OT dan panjang gelombang maksimum uji
aktivitas antioksidan
a. Penentuan Operating Time OT Penentuan OT dilakukan untuk melihat waktu yang diperlukan oleh
larutin uji dengan DPPH untuk berekasi secara sempurna. Pada penentuan OT ini untuk larutan pembanding dilakukan pada konsentrasi 15 µgml, 20 µgml , dan
25 µgml. Dilakukan pengukuran absorbansi dari menit ke 5 sampai menit ke 60, pembacaan absorbansi dilakukan setiap 5 menit. OT ditandai dengan penurunan
absorbansi yang relatif lebih stabil. Dilakukan juga untuk larutan uji sebesar 350 µgml, 400 µgml dan 450 µgml. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali.
b. Pengukuran panjang gelombang maksimum Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan pada konsentrasi
DPPH sebesar 0,02 mM, 0,04 mM dan 0,08 mM. Dilakukan scanning pada panjang gelombang 400-600 nm, kemudian penentuan panjang gelombang
maksimum didapatkan dari hasil ketiga rata-rata pengukuran DPPH dengan tiga konsentrasi yang berbeda.
7. Uji pendahuluan dan estimasi aktivitas antioksidan pada larutan uji dan
pembanding
a. Uji pendahuluan Disiapkan 3 buah tabung reaksi. Pada tabung pertama diisi dengan
menggunakan 1 ml metanol p.a. dan 1 ml larutan DPPH 0,4 mM, tabung kedua dengan 1ml larutan uji rutin sebesar 20 µgml dan 1 ml larutan DPPH 0,4 mM,
tabung ketiga dengan 1 ml larutan uji sebesar 400 µgml dan 1 ml larutan DPPH , setelah itu diamkan selama 30 detik dan amati perubahan warna yang terjadi.
b. Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan larutan pembanding Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan dari senyawa pembanding
yaitu rutin dilakukan pada seri larutan baku 15 µgml, 17,5 µgml, 20 µgml, 22,5µgml dan 25 µgml. Setelah itu, direkasikan dengan larutan DPPH 0,4 mM
dan diamkan selama OT, yaitu 30 menit dan pengukuran dilakukan pada panjang gelombang maksimum, yaitu 515,5 nm. Pengukuran dilakukan dengan replikasi
sebayak 3 kali. c. Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan larutan uji
Estimasi pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan pada seri larutan baku sampel 350 µgml, 375 µgml, 400 µgml, 425 µgml dan 450 µgml. Setelah
itu direaksikan dengan larutan DPPH 0,4 mM dan diamkan selama OT, yaitu 30 menit dan pengukuran dilakkukan pada panjang gelombang maksimum yaitu
515,5 nm. Pengukuran dilakukan dengan replikasi sebanyak 3 kali.
F. Analisis Hasil
Analsis hasil untuk pengukuran aktivitas antioksidan yang dinyatakan sebagai IC dapat dilakukan dengan rumus :
Absorbansi
DPPH
– Absorbansi
sampel
x 100 Absorbansi
DPPH
Kemudian dari data itu dianalisis dan dihitung nilai IC
50
yang didapatkan dari persamaan regresi linear. Persamaan regresi linear diperoleh dengan
memplotkan antara sumbu X sebagai konsentrasi larutan ujipembanding dan
sumbu y adalah nilai IC dan kemudian dibandingkan terdapat perbedaan yang bermakna antara nilai IC
50
dari sampel dan pembanding. Penetapan kandungan senyawa fenolik total yang dinyatakan sebagai
mg ekivalen asam galat per gram fraksi etil asetat diperoleh dengan memasukkan absorbansi dari larutan uji ke dalam persamaan regresi linear dari kurva baku
asam galat.
36
BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
Pada percobaan kali ini, peneliti menggunakan sumber acuan yang sesuai dan kemudian dicocokkan dan hasilnya menunjukkan bahwa tanaman yang
dimaksud adalah selada air Nasturtium officinale R. Br yang digunakan pada penelitian ini.
B. Pengumpulan Bahan
Pengumpulan bahan dilakukan di Kaliurang, Yogyakarta. Pemanenan dilakukan pada pagi hari sebelum matahari terbit dan kemudian sesegera mungkin
dibawa ke laboratorium untuk dicuci dan segera dilakukan pengeringan. Pada penelitian ini sampel tanaman herba selada air diperoleh dari pemasok sayuran
segar di Yogyakarta yaitu Depo Sayur Segar yang berada di Jalan Monjali. Sampel segar yang diperoleh dipanen pada pagi hari sebelum matahari terbit,
tujuannya adalah supaya tidak terjadinya peristiwa browning. Peristiwa Browning ini dapat terjadi karena proses adaptif dari tanaman karena adanya luka atau
karena proses penuaan. Peristiwa browning dapat disebabkan karena adaanya pengaruh enzimatik dalam tanaman itu sendiri, yaitu senyawa fenolik yang
terdapat dalam tanaman oleh pengaruh enzim polifenol oksidase dengan bantuan oksigen akan mengubah gugus monofenol menjadi gugus O- hidroksi fenol yang
selanjutnya diubah lagi menjadi O-kuinon, gugus inilah yang akan memberikan warna coklat Thipyapong, Stout, and Attajarusit, 2007.
Kategori