Analisis aktivitas antioksidan DPPH Molyneux 2004

a Tahap pembuatan hidrolisat protein Tahap preparasi contoh adalah pembuatan hidrolisat protein. Prosedurnya sebagai berikut: contoh ditimbang sebanyak 0,2 g dan dihancurkan. Contoh yang telah hancur ditambahkan dengan HCl 6 N sebanyak 5-10 mL, kemudian dipanaskan dalam oven pada suhu 100ºC selama 24 jam. Hal ini dilakukan untuk menghilangkan gas atau udara yang ada pada contoh agar tidak mengganggu kromatogram yang dihasilkan, selain itu pemanasan dilakukan untuk mempercepat reaksi hidrolisis. Setelah pemanasan selesai, hidrolisat protein disaring dengan milipore berukuran 45 mikron. b Tahap pengeringan Hasil saringan diambil sebanyak 30 μL larutan pengering. Larutan pengering dibuat dari campuran antara metanol, natrium asetat, dan trietilamim dengan perbandingan 2:2:1. Setelah ditambahkan dengan larutan pengering, dilakukan pengeringan dengan gas nitrogen untuk mempercepat pengeringan dan mencegah oksidasi. c Tahap derivatisasi Sebanyak 30 μL larutan derivatisasi ditambahkan pada hasil pengeringan. Larutan derivatisasi dibuat dari campuran antara larutan metanol, pikoiotisianat, dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4. Proses derivatisasi dilakukan agar detektor mudah untuk mendeteksi senyawa yang ada pada contoh, kemudian dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan 10 mL asetonitil 60 atau buffer fosfat 0,1 M lalu dibiarkan selama 20 menit. Hasil pengenceran disaring kembali menggunakan milipor berukuran 0,45 mikron. d Injeksi ke HPLC Hasil saringan diambil sebanyak 20 μL untuk diinjeksikan ke dalam HPLC. Penghitungan konsentrasi asam amino dilakukan dengan cara membandingkan kromatogram contoh dengan standar, pembuatan kromatogram standar menggunakan asam amino yang mengalami perlakuan yang sama dengan contoh. Kandungan masing-masing asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus: Keterangan : C = konsentrasi standar asam amino FP = faktor pengenceran BM = bobot molekul dari masing-masing asam amino Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino: Merek : Waters Coorporation, USA Kolom : accQtag column 3,9 x 150 mm Temperatur : 37 o C Fase gerak : acetonitril 60 - AccqTag Eluent A, sistem komposisi gradien Laju alir : 1,0 mL per menit Detektor : fluorescense, Eksitasi = 250 nm, emisi = 395 nm Volume penyuntikan : 5 uL Nama standar : Amino acid standard produksi Thermo Scientific

3.4.8 Uji stabilitas

Produk yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik diantara perlakuan yang diterima secara organoleptik, dilanjutkan pengujiannya untuk melihat stabilitas produk terhadap waktu penyimpanan. Pengujian masa simpan dilakukan dengan percepatan waktu atau model akselerasi menggunakan metode Arrhenius. Model Arrhenius dilakukan dengan menyimpan produk pangan dengan kemasan akhir pada minimal tiga suhu penyimpanan ekstrim. Hasil pengamatan bagi setiap parameter dihitung laju penurunan mutunya per 7 hari menggunakan plot Arrhenius dalam grafik hubungan antara nilai ln k apabila mengikuti ordo reaksi satu, dan ln k nol apabila mengikuti ordo reaksi nol sebagai sumbu y dan sebagai sumbu x nya adalah suhu pada masing-masing penyimpanan 30 o C, 35 o C, dan 45 o C, kemudian dicari nilai ln k nya atau nilai konstanta penurunan mutu per hari yang diperoleh dari kemiringan persamaan regresi grafik masing-masing suhu penyimpanan tersebut. Nilai k merupakan gradien dari regresi linier yang didapat dari ketiga suhu penyimpanan. Berdasarkan regresi linier yang diperoleh pada kurva Arrhenius ini dapat diprediksi umur simpan produk dengan menggunakan rumus: k = k o e –ERT .