Prinsip Kerja Penelitian Tempat dan Waktu Penelitian Uji Antidiabetes Ekstrak Dengan Mekanisme Penghambatan Enzim

38 BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Prinsip Kerja Penelitian

Sampel kulit batang raru Vatica pauciflora Blume diekstraksi dengan metode ekstraksi bertingkat dengan pelarut yang berbeda tingkat kepolarannya: n-heksan, etil asetat, etanol 96, dan air. Kemudian masing – masing ekstrak yang telah dipekatkan, diuji toksisitasnya Metode BSLT, dan bioaktivitas penghambatan terhadap enzim α-glukosidase secara in vitro. Ekstrak yang mempunyai bioaktivitas paling tinggi dianalisis dengan kromatografi lapis tipis, kemudian difraksinasi dengan kromatografi kolom, kemudian fraksi-fraksi yang diperoleh diuji bioaktivitasnya sebagai penghambat α-glukosidase secara in vitro. Fraksi yang paling tinggi bioaktivitasnya dilanjutkan pemurniannya hingga diperoleh isolat murni. Isolat murni ditentukan struktur kimianya dengan pengambilan data-data spektrofotometri UV-VIS, spektrofotometer Fourier- Transform Infrared FTIR 1 , spektrometri Resonansi Magnetik Inti RMI 1D, 2DCOSY, HMQC, HMBC, dan HR-MS.

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Lab Kimia Organik Bahan Alam FMIPA USU, Laboratorium Kimia Bahan Alam Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong dan Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam KOBA Institut Teknologi Bandung ITB . Penelitian dimulai dari April 2012 sampai Maret 2013. Universitas Sumatera Utara 39 3.3 Bahan, Alat, dan Prosedur Penelitian 3.3.1 Bahan Sampel yang digunakan adalah kulit batang Raru Vatica pauciflora Blume yang berasal dari Tapanuli Tengah. Dan bahan Kimia yang digunakan adalah n-heksan, etil asetat, etanol 96, air suling, kloroform, metanol, asetonitril, serium sulfat, lempeng KLT silika gel GF 254 , silika gel 60 mesh, sea sand, celite, acarbose, dimetilsulfoksida DMSO, kalium fosfat monobasa, natrium karbonat, p-nitrofenil- α-D-glukopiranosa, enzim α-glukosidase, ammonia, pereaksi Dragendorf, asam asetat anhidrat, pereaksi liberman buchard, serbuk Mg, HCl, FeCl 3 1, formaldehid 30, NaOH, proteleum eter.

3.3.2 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian adalah alat refluks, corong gelas, penguap putar vakum rotavapor, sonikator, botol kaca, penangas air, cawan petri, batang pengaduk, spatula besi, vial, timbangan analitik, tabung reaksi, rak tabung reaksi, mikropipet, inkubator, bejana kromatografi, pipa kapiler, pinset, pemanas KLT, kolom kromatografi, labu erlenmeyer, gelas piala, pipet tetes, spektrofotometer UV-Vis, spektrofotometer Fourier-transform Infrared FTIR, spektrometri resonansi magnetik inti RMI 1 D 1 H. 13 C dan DEPT dan RMI 2 D COSY, HMQC, HMBC.

3.3.3 Prosedur Penelitian 1. Persiapan Sampel

Kulit batang raru Vatica pauciflora Blume, dikoleksi dari hutan Tapanuli Tengah, dibersihkan dari kotoran, dan selanjutnya dikeringkan di udara terbuka Universitas Sumatera Utara 40 dalam ruangan sehingga tidak terkena panas matahari langsung. Setelah kering dibuat potongan kecil–kecil.

2. Ekstraksi Kulit Batang Raru Vatica pauciflora Blume

Ekstraksi dilakukan dengan metode Harborn Harborn,1987. Metode yang dilakukan adalah metode ekstraksi bertingkat menggunakan pelarut yang berbeda tingkat kepolarannya yaitu: n-heksan, etil asetat, etanol, dan air. Masing-masing ekstrak dikumpulkan dan diuapkan dengan menggunakan rotavapor sampai pekat kental. Prosedur yang dilakukan adalah sebanyak 1 Kg kulit batang tumbuhan raru direfluks dengan pelarut n-heksan. Kemudian filtratnya diuapkan dengan vakum rotavapor sehingga didapat ekstrak kental n-heksan. Ekstraksi dilakukan berulang sampai tidak terjadi perubahan warna pada pelarut yang digunakan. Residu kemudian direfluks kembali dengan etil asetat sampai tidak terjadi perubahan warna kemudian disaring dan filtratnya dirotari evaporator disebut fraksi etil asetat. Residu dari sampel setelah direfluks etil asetat dilakukan kembali refluks dengan etanol sampai tidak terjadi perubahan warna kemudian disaring dan filtratnya dirotari evaporator disebut fraksi etanol. Residu dari sampel setelah direfluks etanol dilakukan kembali refluks dengan air sampai tidak terjadi perubahan warna kemudian disaring dan filtratnya dirotari evaporator dan residu dibuang.

3.4 Uji Antidiabetes Ekstrak Dengan Mekanisme Penghambatan Enzim

α- Glukosidase Secara In Vitro Sugiwati, 2009. Pembuatan Larutan Dapar Fosfat 0,1 M. Untuk membuat larutan ini adalah dengan mengambil sebanyak 13,61 g kalium fosfat monobasa, ditimbang dan Universitas Sumatera Utara 41 dilarutkan dalam 500 mL air suling Larutan A. Kemudian sebanyak 17,43 g kalium fosfat dibasa ditimbang dan dilarutkan dalam 500 mL air suling Larutan B. Larutan A diambil 39 mL dan dari larutan B diambil 61 mL kemudian diencerkan hingga 200 mL dengan air suling, lalu cek pH 7,0. Pembuatan Larutan Dapar Fosfat 0,01 M dilakukan dengan mengambil sebanyak 5 mL larutan dapar fosfat 0,1 M pH 7,0 ditambahkan dengan 45 mL air suling, selanjutnya dicek pH 7,0. Pembuatan Larutan p-nitrofenil- α-D-glukopiranosa 0,5 mM dilakukan dengan mengambil sebanyak 3,1 mg p-nitrofenil- α-D-glukopiranosid, ditimbang secara seksama dan dilarutkan dalam 20 mL dapar fosfat pH 7,0. Pembuatan Larutan Natrium Karbonat 0,2 M dilakukan dengan mengambil sebanyak 2,12 g natrium karbonat ditimbang dan dilarutkan dalam 100 mL air suling. Pembuatan Larutan Enzim dilakukan dengan mengambil sebanyak 1,0 mg α-glukosidase ditimbang dan dilarutkan dalam 1 mL dapar fosfat 0,01 M, kemudian larutan dipipet 12 μL dan diencerkan hingga 30 mL menggunakan dapar fosfat 0,01 M. Pembuatan Larutan Uji dilakukan dengan membuat 1 Larutan Dengan Enzim S 1 . Sejumlah sampel ekstrak ditimbang seksama sebanyak 1,0 mg dilarutkan dalam 2 ml DMSO 500 ppm, kemudian diencerkan menjadi 50 ppm. Sejumlah 25 μL larutan sampel dipipet dan ditambahkan dengan 475 µL dapar fosfat 0,1 M pH 7,0. Sejumlah 250 μL p-nitrofenil α-D-glukopiranosid 0,5 mM ditambahkan kemudian diprainkubasi di penangas air pada suhu 37°C selama 5 menit, lalu ditambahkan 250 μL larutan enzim dan diinkubasi kembali pada suhu Universitas Sumatera Utara 42 37°C selama 25 menit. Setelah 30 menit, ditambahkan 1000 μL natrium karbonat 0,2 M. Serapan dibaca pada panjang gelombang 400 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. 2 Larutan Tanpa Enzim S . Sejumlah sampel ekstrak ditimbang seksama sebanyak 1,0 mg dilarutkan dalam 2 mL DMSO 500 ppm, kemudian diencerkan menjadi 50 ppm. Sejumlah 25 μL larutan sampel dipipet dan ditambahkan dengan 475 µL dapar fosfat 0,1M pH 7,0. Sejumlah 250 μL p- nitrofenil α-D-glukopiranosid 0,5 mM ditambahkan kemudian diprainkubasi di penangas air pada suhu 37°C selama 5 menit, lalu ditambahkan 250 μL dapar fosfat 0,01 M pH 7,0 dan diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 25 menit. Setelah 30 menit, ditambahkan 1000 μL natrium karbonat 0,2 M. Serapan dibaca pada panjang gelombang 400 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. 3 Pembuatan Larutan Acarbose. Sejumlah 1,0 mg acarbose ditimbang seksama dan dilarutkan dalam 2 mL DMSO 500 ppm, kemudian diencerkan menjadi 50 ppm dan diperlakukan sama seperti larutan uji dengan dan tanpa menggunakan larutan enzim. 4 Pembuatan Larutan Kontrol. Sejumlah 25 μL DMSO dipipet dan ditambahkan dengan 475 µL dapar fosfat 0,1 M pH 7,0. Sejumlah 250 μL p- nitrofenil α-D-glukopiranosid 0,5mM ditambahkan kemudian diprainkubasi di penangas air pada suhu 37°C selama 5 menit, lalu ditambahkan 250 μL larutan enzim dan diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 25 menit. Setelah 30 menit, ditambahkan 1000 μL natrium karbonat 0,2 M. Serapan dibaca pada panjang gelombang 400 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Universitas Sumatera Utara 43 5 Pembuatan Larutan Blangko. Sejumlah 25 μL DMSO dipipet dan ditambahkan dengan 475 µL dapar fosfat 0,1 M pH 7,0. Sejumlah 250 μL p- nitrofenil α-D-glukopiranosid 0,5 mM ditambahkan kemudian diprainkubasi di penangas air pada suhu 37°C selama 5 menit, lalu ditambahkan 250 μL dapar fosfat 0,01 M pH 7,0 dan diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 25 menit. Setelah 30 menit, ditambahkan 1000 μL natrium karbonat 0,2 M. Serapan dibaca pada panjang gelombang 400 nm menggunakan spektrofotometer UV-Vis. Cara Penetapan ditentukan melalui persentase aktivitas penghambatan yang dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut : Dimana : C = Absorbansi aktivitas enzim tanpa sampel kontrol- blangko S = Absorbansi aktivitas enzim dengan sampel S 1 - S Penentuan IC 50 Fraksi dan Acarbose, yaitu fraksi yang paling aktif ditentukan konsentrasi penghambatan 50 IC 50 dengan menggunakan 5 variasi konsentrasi larutan sampel. Kontrol positif yang digunakan adalah acarbose sebagai pembanding

3.5 Pengujian Toksisitas Dengan BSLT