37 kebutuhan airnya mencukupi, setelah berumur sekitar 2
– 3 minggu, semaian telah memiliki lebih kurang 3-4 lembar daun Gambar 3. Semaian kemudian siap
untuk ditandai dengan spidol dan ditetesi dengan larutan higromisin 100 mgl. Larutan penguji ini terdiri dari: 0,01 gelrite 1000 µl yang telah dipanaskan, 780
µl air steril, 1 triton X-00 200 µl, setelah suhu mencapai 30
o
C, ditambahan 20 µl hygromisin stok 50 µgml. Larutan control dibuat dan digunakan tanpa
higromisin. Pada helaian daun yang telah diberi tanda sebelumnya dengan spidol warna hitam, diolesi dengan larutan higromisin tadi, untuk kontrol digunakan
larutan penguji tanpa ditambahi dengan hygromisin. Pengamatan ketahanan daun tanaman pada higromisin dilihat setelah tiga hari perlakuan. Jika daun yang
diolesi higromisin berubah menjadi nekrotik, berarti tanaman peka terhadap antibiotik higromisin, dan tidak perlu dilanjutkan dengan analisis PCR. Apabila
diperoleh semaian yang tidak mengalami nekrotik, dilanjutkan dengan analisis PCR
Gambar 3. Tanaman padi umur 2 – 3 minggu untuk persiapan seleksi
higromisin
2. Analisis PCR Polymerase Chain Reaction
Analisis PCR digunakan untuk mengetahui apakah telah terjadi integrasi gen pada tanaman Padi non-PRG karena adanya persilangan crossing dengan
tanaman Padi Bt PRG. Pada analisis PCR digunakan DNA tanaman kontrol positif mengandung gen Cry IAb dan DNA tanaman kontrol negatif yang tidak
mengandung gen Cry IAb. Sampel daun dari tanaman Padi non PRG yang tidak mengalami nekrotik pada uji higromisin diisolasi dengan menggunakan metode
Zheng et al. 1995. DNA sampel tanaman hasil penelitian gene flow di LUT yang
38 tidak lolos seleksi higromisisn, diisolasi dari daun. Daun sepanjang ± 2 cm
dipotong-potong, kemudian ditambah 750 µl dapar isolasi DNA 0.2 M Tris-HCl pH 7.5, 0.05 M EDTA, 2 M NaCl dan 2 CTAB, dapar ekstraksi sorbitol 0.35
M, Tris-HCl pH 7.5, 0.1 M dan 5 mM EDTA ditambah 5 sarkosil. Selanjutnya reaksi diinkubasi pada suhu 65
C selama 1 jam. Kemudian ditambahkan 750 µl chloroform:isoamylalkohol 24:1 dan disentrifugasi selama 5 menit pada
kecepatan 8.000 rpm pada suhu 40C. Supernatan dipindahkan ke tabung baru dan ditambah dengan 400 µl isopropanol dingin, dan disentrifugasi selama 8 menit
dengan kecepatan 8.000 rpm pada suhu 40
o
C. Supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan 70 etanol. Pelet dalam tabung dikeringkan dan dilarutkan dengan
30-50 µl dapar TE pH 8.0. Untuk uji PCR, volume 1 x reaksi PCR ialah 20 µl dengan komposisi seperti pada Lampiran 2. Primer yang digunakan adalah hpt
5’– GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG-
3’ dan 5’ – GCACTCCCCGCCTGCAC-3’. Volume 1 x reaksi PCR ialah 20 µl dengan komposisi seperti pada
Lampiran 1.
Primer yang
digunakan adalah
hpt 5’–
GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG- 3’ dan 5’ – GCACTCCCCGCCTGCAC-3’.
Kemungkinan terjadinya persilangan atau perpindahan material genetik dari tanaman Padi Bt ke tanaman Padi non-Bt, yang diamati untuk setiap
perlakuan berdasarkan jarak isolasi di lapangan yaitu 1, 2, 3, 5, 7, 9, 11, 13 dan 15 meter dari tanaman Padi Bt PRG, dengan menggunakan pola penanaman
berbentuk lingkaran, dimana pada linkaran bagian dalam ditanami dengan padi Bt PRG dan seterusnya pada setiap jari-jari lingkaran ditanam dengan beberapa
kultivar tanaman padi non-PRG. Secara keseluruhan pola penanaman padi yang dilakukan Puslit Bioteknologi LIPI berbentuk pola lingkaran menyerupai baling-
baling Lampiran 2.
HASIL DAN PEMBAHASAN
a. Kajian Keamanan Lingkungan terhadap Pengaruh Padi Bt PRG terhadap
Serangga non-target di LUT
Berdasarkan hasil pengamatan yang telah dilakukan oleh Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI di LUT yang bekerja sama dengan Balitpa Padi Sukamandi,
telah diperoleh hasil penelitian, terhadap pengaruh tanaman Padi Bt PRG pada
