INTRUMENTASI KCKT VALIDASI METODE ANALISIS V V

gerak, kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik fase diam kurang polar dari- pada fase gerak, kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan buffer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol.

2.5.3 Pompa pada KCKT

Pompa yang digunakan untuk KCKT adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni pompa harus inert terhadap fase gerak. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 1-3 mLmenit. Untuk tujuan prepa- ratif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mLmenit. Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reproduksibel, konstan dan bebas dari gangguan.

2.5.4 InjektorPenyuntikan Sampel Pada KCKT

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel sampel loop internal atau eksternal. Pada saat pengisian sampel digelontor melewati keluk sampel dan kelebihannya dikeluarkan ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan

2 2

2 2. 5. 5. 5. 5.

5. 5

5 5

5 5.

5 5

3 3

2 2

2 2.5.4 mengge lontor sampel ke kolom. Presisi penyuntikan dengan keluk sampel ini dapat mencapai nilai RSD 0,1.

2.5.5 Kolom Pada KCKT

Kolom KCKT pada umumnya terbuat dari pipa baja tahan karat. Panjang kolom antara 10-30 cm dengan diameter dalam 4,5-5,0 mm. Kolom diisi dengan yang sesuai untuk pemisahan sampel tertentu. Kolom untuk pemisahan analitik umumnya mempunyai diameter dalam 2-4 mm. Kolom dapat dipanaskan sampai 60 o C agar dihasilkan pemisahan yang lebih efisien. Jika tidak dinyatakan lain, kolom dipertahankan pada suhu kamar. Fase diam pada KCKT berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzene. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol Si-OH, Oktadesil silan ODS atau C18 merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Fase diam eksklusi dan penukar ion dapat menggunakan silika atau polimer.

2.5.6 Detektor KCKT

Detektor pada KCKT ada 2 yaitu 1 Detektor universal yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik dan tidak bersifat selektif seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa, dan 2 Detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detector UV-VIS, detektor fluoresensi dan elektro kimia.

2.5.7 Komputer, Integrator atau Rekorder.

Alat pengumpul data seperti komputer, integrator atau rekorder, dihubungkan dengan detektor. Alat ini akan mengukur sinyal elektro- nik yang dihasilkan oleh detektor lalu memplotkannya sebagai suatu kromatogram.

2.6 VALIDASI METODE ANALISIS

Suatu metode analisis terdiri atas serangkaian langkah yang harus diikuti untuk tujuan analisis kualitatif dan kuantitatif dengan menggunakan teknik tertentu. Faktor-faktor yang harus diperhatikan dalam melakukan pemilihan metode analisis adalah: tujuan analisis, biaya yang dibutuhkan, serta waktu yang diperlukan; level analit yang diharapkan dan batas deteksi yang diperlukan; macam sampel yang akan dianalisis serta pra-perlakuan sampel yang dibutuhkan; jumlah sampel yang dianalisis; ketepatan dan ketelitian yang diinginkan untuk analisis kuantitatif; ketersediaan bahan rujukan, senyawa baku, bahan-bahan kimia, dan pelarut yang dibutuhkan; peralatan yang tersedia; kemungkinan adanya gangguan pada saat deteksi atau pada saat pengukuran sampel. Menurut Rohman dan Ibnu 2007, kriteria yang harus dipenuhi suatu metode analisis yang baik adalah: 1. Peka sensitive artinya metode harus dapat digunakan untuk menetapkan kadar senyawa dalam konsentrasi yang kecil. 2. Selektif, artinya untuk penetapan kadar senyawa tertentu, metode tersebut tidak banyak terpengaruh oleh adanya senyawa lain. 3. Tepat precise artinya metode tersebut menghasilkan suatu hasil analisis yang sama atau hampir sama dalam satu seri pengukuran penetapan. 4. Teliti accurate artinya metode dapat menghasilkan nilai rata-rata mean yang sangat dekat dengan nilai sebenarnya true value. 5. Kasar rugged artinya ada perubahan komposisi pelarut atau variasi lingkungan tidak menyebabkan perubahan hasil analisis. 6. Praktis artinya metode tersebut mudah dikerjakan serta tidak banyak memerlukan waktu dan biaya. Pengembangan metode analisis biasanya didasarkan pada metode yang sudah ada menggunakan instrumen yang sama atau hampir sama. Pengem- bangan metode analisis biasanya membutuhkan syarat-syarat metode tertentu dan memutuskan jenis alat yang akan digunakan. Pada tahap pengembangan metode, keputusan yang terkait dengan pemilihan kolom,

2.6 V V

V VAL diik tek pe p p m se se s se se se e se se se se se se se se s se se e se se se se se se e se se e se se e se se e se s s e se se s s e e e se se e s s e se e s s s e e se se e e s s e e e e e e e e e e se e e s e e s s e e s e e s se s r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r ya ya ya ya ya y ya y ya ya y ya ya y y ya ya ya ya ya ya y ya y y a y y ya y y ya y y y y ya y ya ya y y y y y ya a ya ya y y y a y y y ya ya y ya ya y y a y y y ya y y y y y ya y y y y y y y ya y a a ya y y a y y y y ya y ya y y y y y y y y y ya y y a a a y y y y y y y y y y y y y y n sa sa sa sa sa sa sa sa sa sa sa s s sa sa sa sa sa a sa s sa sa a s a a a a sa sa sa sa sa sa a a a s sa a a s sa s sa s sa s s sa a a s s s sa a sa s s sa s s s sa s s s s a a s s a sa s a s s a s a s s a m ke ke ke ke ke ke e ke ke ke k ke ke ke e k ke ke e k ke ke ke ke ke k ke ke k k k k k k e e ke ke k k k ke ke k k ke k e e e k ke e ke ke e e e ke k k k k k k k ke e k ke k k k ke k k k k k k k k ke e e t ru ru ru ru ru ru ru ru ru ru ru ru ru ru r ru r ru u u u u u u ru u ru ru r ru ru ru u ru ru u u r r ru u u r ru u u u ru ru r r u ru u r ru ru ru ru u r r u u u r ru u r ru u r r ru r r r u u r r u u r r u u r r r j j j j j j j j j jj pe pe pe p p pe pe pe p pe p pe pe pe pe pe pe p pe pe p p p e pe e pe e pe pe pe pe pe pe pe p p e e pe e pe e pe p pe e p p p e pe pe p p pe pe e p pe pe pe p p p p p pe e p pe e p p p pe p p e p p p p p p p p p p p p p p p p p p r at at at at at a at at at t at at at t at at at a at at at at at at a at a at t at a a a a a a at at at t at a at a at at at at a a at at a a a at a at a a at t at at a at a at t a a at t at a a a a t a at a t t a at a at t a at t a a t at a at a a a a a at a t t a t t t t t a a a k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k ri r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r 1. 1. 1. 1. 1.

1. 1

1 1.

1 1

1 1. 1 1.

1 1

1 1.

1. 1

1. 1.

1. 1

1 1

1. 1

1 1.

1. 1

1 1

1. 1

1 1

1. 1

1 1

1 1.

1 1

1 .

1 1

1 2. 2.

2 2

2 2.

2. 2

2 2.

2 2

2 2.

2. 2

2 2

2. 2

2 2

2 2.

2 2

2 2. 2. 2. 2 2.

2. 2

2 2

3. 4. 5. 6. 6. 6. 6. 6 6 6 6. 6. 6 6 6 6 6. 6 6 6 6 6 6 6 6. 6 6 6 6. 6 6. 6. 6 6 6 6 6. 6 6 6 6 6 6 6. 6 6 6 6. 6 6 6. 6 . 6. 6 6 6 6. 6 6 6 . 6 6 6 6 6. 6. 6. 6. 6. . . 6 6 su su su u su su u u su su u u u u su u u u u u u u su su u su u u su u u su su su u u u su u u su u u u u u su su u u u u su u u u su u u u u s d d d d d d d d d d d d d d d d d d d d ba ba ba ba ba b a ba ba ba ba ba ba b ba b b b b b b b a ba b b b b b ba b b b b b b b b b b b b b b b ba a a a a a a a a n te te t te te te te te t t te t t te t t t te t t t t t t t t t te t te e e te te te te e te e e te e e r r r pe pe pe pe pe pe p pe p pe pe pe pe pe pe p pe pe e pe pe pe p p pe pe pe p e pe p pe p pe p p p p p p p p p p p p pe e e e e p pe e e e p p p p p e pe pe pe e e n n n n fase gerak, detektor dan metode kuantisasi harus diperhatikan. Ada beberapa alasan tertentu untuk pengembangan metode analisis yang baru, yaitu: 1. Belum ada metode yang sesuai untuk analit tertentu dalam suatu matriks sampel tertentu. 2. Metode yang sudah ada terlalu rumit, terlalu banyak tahap perlakuan yang dapat menimbulkan kesalahan atau metode yang sudah ada tidak reliabel presisi dan akurasinya rendah. 3. Metode yang sudah ada terlalu mahal, membutuhkan waktu dan energi yang besar atau tidak dapat diotomatisasikan. 4. Metode yang sudah ada tidak memberikan sensitivitas atau spesifisitas yang mencukupi pada sampel yang dituju. 5. Adanya kebutuhan untuk pengembangan metode alternatif, baik untuk alasan legal atau alasan saintifik. Suatu metode perlu divalidasi terlebih dahulu sebelum metode tersebut digunakan untuk penggunaan lebih lanjut, sehingga metode tersebut dapat menjamin bahwa analisis yang dilakukan dapat dipercaya dan sesuai dengan tujuan penggunaanya serta dapat diandalkan untuk mengambil keputusan. Metode analisis yang akan digunakan harus disesuaikan dengan kondisi laboratorium, peralatan dan pereaksi yang tersedia. Walaupun metode analisis vitamin A dalam minyak goreng sawit masih sulit didapat, namun metode analisis vitamin A dalam produk pangan dengan menggunakan peralatan moderen, diantaranya dengan menggunakan KCKT sudah banyak yang dikembangkan oleh peneliti terdahulu. Namun kelemahanya dari metode yang ada adalah kerumitan dalam penyiapan sampel saponi- fikasi, ekstraksi dan pemekatan atau penguapan pelarut organik yang digunakan. Metode analisis yang dikembangkan oleh peneliti ini dipilih karena memiliki banyak kelebihan, yaitu metodenya tanpa proses saponi- fikasi, ekstraksi dan penguapan pelarut organik yang digunakan sehingga waktu analisinya relatif lebih cepat. Menurut Gunzler 1996, validasi metode adalah menetapkan dengan percobaan laboratorium yang sistimatik, pemenuhan karakteristik unjuk kerja metode terhadap spesifikasi yang dikaitkan dengan penggunaan hasil pengujian yang dimaksudkan. Karakreristik unjuk kerja parameter yang ditetapkan mencakup: presisi, akurasi, selektivitas dan spesifisitas, batas deteksi, batas kuantisasi, rentang, linieritas, sensitivitas dan kekasaran ruggedness. Menurut Harmita 2004, beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis yaitu kecermatan akurasi, keseksamaan presisi, selektivitas spesifisitas, linearitas dan rentang, batas deteksi dan batas kuantitasi, ketangguhan metode ruggedness dan kekuatan metode robustness. Validasi metode adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu tujuan khusus dipenuhi. Proses validasi suatu metode biasanya sangat dekat dengan proses pengembangan suatu metode. Sebuah metode harus divalidasi bila kinerja parameter metode uji tersebut belum valid atau belum dibuktikan valid untuk penggunaan analisis khusus BSN 2005. Tujuan memvalidasi metode adalah untuk mengetahui sejauh mana penyimpangan suatu metode tidak dapat dihindari pada kondisi normal, dimana seluruh elemen terkait telah dilaksanakan dengan baik dan benar. Dengan memvalidasi metode, tingkat kepercayaan yang dihasilkan oleh suatu metode pengujian dapat diperkirakan dengan pasti Hadi, 2007 Menurut USP Convention 2009, presisi adalah derajat kesesuaian diantara hasil uji individu berdiri sendiri jika metode uji dilakukan berulang-ulang terhadap multi sampling dari suatu sampel yang homogen. Presisi biasanya dinyatakan sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif koefisien variasi dari serangkaian pengukuran. Presisi hendaknya dilakukan pada tiga tingkat berbeda yaitu: ripitabilitas, presisi intermediat dan reprodusibilitas. Ripitabilitas adalah penggunaan metode pengujian di dalam satu laboratorium dalam satu periode waktu yang singkat menggunakan personel penguji yang sama, dengan peralatan yang sama di bawah kondisi sekonstan mungkin. Presisi intermediat dilakukan dengan berbagai variasi di dalam laboratorium, seperti pada hari yang berbeda atau personil penguji yang berbeda atau alat yang berbeda dalam laboratorium yang sama. Reprodusibilitas atau disebut juga ruggedness adalah penggunaan metode pen dite det ru har ak re re re re re re re re re re re re re re re r re re re re re re re re re re e re re re r re r r e e re re re re re re r r r r e re re r e re re r e r e re r re re re re re r e re re r re r re r re re r e e re r e e e e e e n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n n r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r u u u u u u u u u u u u u u u u u bu bu bu bu bu bu u bu bu bu b bu bu bu u bu bu bu u b bu bu bu bu bu u bu bu b b b bu bu bu u u u bu u u u u u u u u u u u u u u u u u u u u bu b b u u b b b u u b bu b bu b u b b b b u u u u u u u u k di di di di di di di di di di di di di di d di d di i i di d d di di di di d d d d d di d i d di di di di d di di di di d di d i d d i d d d di di d i i di i di d d d d d i d d d d i d i i d d d d i i d d d d i i d d i i p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p p pe pe pe p p pe pe pe pe pe e pe pe pe pe pe pe p pe pe p pe pe e pe e pe e pe e pe pe pe e pe pe p e e pe e pe e pe e pe e p p e e pe pe p p e pe pe e p e pe pe p p p p p pe e pe e e e e e e p e p p p p p p p pe e p p p p p p p p p n pa pa pa pa pa pa pa pa pa pa pa pa p a pa a pa p p p p pa pa pa pa a pa pa p pa pa p pa pa pa pa pa p pa pa pa p p pa pa p pa p a a pa pa p pa pa a a a p pa p pa a a pa p p pa p a pa p pa a pa p pa p a a a p pa a p p a pa p pa p a p pa a a a p a a a a a p p p p p p p p p p p r un un un un un un un n un un un un un un un u u un un n un n un un un n un n un n un n n u u u un u un n n n un n n un u u n u u n u un n n n n un u u n n u u un un n n u n u n n u u u n n u u n n t pe pe pe e pe pe pe pe pe pe pe e e e e p pe pe e pe e e e e e p pe pe pe pe pe pe e pe pe pe pe pe e e pe pe e pe e pe pe p e e e pe e pe p pe p pe p pe p p p e e pe p p pe p pe pe e e e p p p p e e e e e pe pe pe p p p p pe p p pe p p p p p p p p p p p p p p p p n di di di di di di di di di di d d di d d i di di di di di di di di di di di di di d di di d d di i di di d d d i di i i i di i di di i d di di i di i di di di d i i i i i d d d d d di i di d i i d di i i i i di di d d di i i di d d d di di i i i i di di i d i i i i d d d d i d d d d d d d i d d m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m De De De De De D D De D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D sua dia ber Pre rela di di d di di di di d di di di di di d d di di di di di di i di di d di i di di d di di i di di di di i i d i d di di d d di d d di d d di d d d di di d d d di di i d d d di i i i i d d di d di d i i di di i i d d d d di i i d d d d d d d i i i i d d d l l l l l l l l l l la la l l la l l la l l la l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l l da d da da da da d da da da da da da d d d d d d d d da da d d da da d d da d da da d d da da da da d da da da da d da da d da a d da da da da d d a da d d a d da da da da a da da da a d d a a da a d a a da da a a da d a a a a a d a a d n da da da da da da da d da da da da da da da da da da d da a d da da da da da da d d a da da da da d da da da da da d da d d d d da da d da da da da a d da a a a da d a a a da d a a a a a a a a a a a a a l na na na na na n n n na na n na na n na n na a a na na na n n n na n n na na n n n n n n na na n na n na n n na n n n na n n n n n na n n n n na n n n n n n n n n n n n n n n na n a n a n n a n na a k k k k k k k k k k k k k k k k k k k k ko ko ko ko ko o ko ko ko ko o ko ko ko ko o ko ko ko ko o ko ko o ko o ko o ko ko ko ko ko ko ko o ko o o o o ko o o o o o ko ko o o ko o ko ko ko o ko k o o o o ko o n n n n n v va v va va va va va va v v v va va v va v va va v v va va v v v v v va v v v v v va v v v va v v v v v v va a v v va a v a a r pe pe p pe pe pe pe pe p pe p pe pe p pe p p pe p pe p p p pe p pe p p p p p pe p p p p p p pe pe pe p p pe pe p p pe e pe p e p e pe pe pe p e ee p p p n Re R Re Re Re R Re Re Re Re Re Re Re R Re Re Re Re R R R Re Re Re R R Re R Re R R R R R Re Re R R R Re R R R R Re R R R R R Re R R R R R R R R R R R R R R R R Re R R R R R R R R R R Re R R R e R e R R e R R R Re Re e e p p p pengujian dalam berbagai laboratorium yang berbeda seperti dalam uji kolaborasi. Akurasi adalah ukuran ketepatan dari suatu metode pengujian, atau kedekatan antara nilai hasil uji yang diukur dengan nilai benar, atau nilai nilai konvensional atau nilai acuan yang dapat diterima USP Convention 2009. Akurasi dari suatu metode dapat dilakukan dengan cara: menggunakan bahan acuan bersertifikat, membandingkan hasil yang benar-benar telah dikarakterisasi dan akurasinya telah ditetapkan atau dengan cara menghitung persen perolehan kembali terhadap sampel yang sudah dispike Wood R 1998. Kriteria kecermatan dalam persen perolehan kembali sangat tergantung kepada konsentrasi analit dalam matriks sampel dan pada keseksamaan metode RSD Oktavia, 2006. Persen rekoveri rata-rata untuk tiap level konsentrasi dinilai terhadap rentang rekoveri pada Tabel 5. Selektivitas menunjukkan kemampuan suatu metode membedakan antara analit yang dituju dan komponen lain bentuk-bentuk analit lain yang mungkin ada dalam matrik untuk mengukur secara akurat dan spesifik analit dalam matriks sampel dengan adanya zat pengganggu. Selektivitas sering- kali dapat dinyatakan sebagai derajat penyimpangan degree of bias metode yang dilakukan terhadap sampel yang mengandung bahan yang ditambahkan berupa cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan Oktavia, 2006. Tabel 5. Keberterimaan akurasi berdasarkan rekoveri No Analit Rasio Analit Satuan Rentang keberterimaan Rekoveri 1 100 1 100 98 – 102 2 10 10 -1 10 98 – 102

3 1

10 -2 1 97 – 103 4 0,1 10 -3 1000 ppm 95 – 105 5 0,01 10 -4 100 ppm 90 – 107 6 0,001 10 -5 10 ppm 80 – 110 7 0,0001 10 -6 1 ppm 80 – 110 8 0,00001 10 -7 100 ppb 80 – 110 9 0,000001 10 -8 10 ppb 60 – 115 10 0,0000001 10 -9 1 ppb 40 – 120 Linieritas adalah kemampuan untuk menghasilkan hasil uji yang sebandingberbanding lurus terhadap konsentrasi analit dalam sampel pada kisaran konsentrasi tertentu. Menentukan kemampuan suatu metode untuk mendapatkan respon yang proporsional terhadap konsentrasi analit Oktavia, 2006. Rentang yaitu kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang kadar analitnya masih linier dengan presisi dan akurasi yang masih dapat diterima. Ditetapkan bersamaan dengan penetapan linieritas dengan melakukan pengujian terhadap sampel yang kadarnya dibawah dan diatas normal. Rentang metoda menjelaskan rentang konsentrasi dimana metode uji diaplikasikan yang dinyatakan dalam presisi, akurasi trueness dan linieritas Oktavia, 2006. Batas Deteksi adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingan dengan blanko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Penentuan batas deteksi suatu metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis itu menggunakan instrumen atau tidak. Pada analisis yang tidak menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blanko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blanko. Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi Oktavia, 2006. seb kis me 200 an an an an an an an an an an an an a an an an an an an an an an n an an an n a a an an an n an an an an an a an an an n an a an a n an an an a a an n n an an n a a n an n a a n n n n a a n an n n a a n a n an n a n n a n n a n n a a n n a a n a an a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a Di Di Di Di D D D Di Di Di Di D D i D Di D D Di D D Di i Di D Di D D D D D i i Di Di Di Di D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D i t uj uj uj uj uj uj uj u uj uj uj uj uj uj uj uj uj uj uj uj uj uj uj uj u uj uj uj uj j u uj uj u uj j j u uj j uj uj uj uj uj uj uj j j uj uj j j uj j uj j u j j j uj u j j u u uj j uj uj uj u j u u j uj u uj u uj u u u uj uj j uj j uj u u u u j j u j u u j uj u u u j uj u u uj u j j j j j j j i ia i i i i i i i i i i i me me me m m m m me m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m ya ya ya ya ya ya ya ya ya ya ya a ya y ya ya y ya y y y a a a a a ya a ya ya y ya y y a ya ya a a y y ya a a y y ya a a ya ya y y a ya a y ya ya y ya a y y y y a y ya a y ya a y y ya ya y y a a y y a a y y a a y ya y y y n 20 20 20 20 20 20 20 2 20 20 20 20 20

20 2

20 20

20 2

20 20 2 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20

20 2

20 20 2 20 20 20

2 2

20 20

2 2

20 20

2 2

2 di di di d di di di d d di di di d di di d di di di i di d di di d di di d d d d d d d d di d di d di di di di d di i i di d di i i di d d i di d d d d di di d i i di i i d d i di i di d i i i d d d di di i d d d i d i i i d d d d d d d d d d d bl bl bl b bl bl b bl bl bl b bl bl bl bl l bl bl bl bl bl bl b bl bl l l l bl b bl b b bl bl bl l bl bl bl bl l l bl l bl l bl bl b b l l bl b b b bl l b b bl l bl b b b l l bl b b b bl l l b bl bl bl l l bl l l l b b bl b b b l l l l l l l l l l l l bl l l l l l b l bl b b b b a a a a a a a a me me m m m me me me me m m m m me e m m m me m m m m e e m m m m m m m m m me m m m m m me m m m m me me m m e me me m me m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m te te te te te te t te e te te te e te te te e te e e e e te e e e e te te e e e te e e e t e e e e e te te e e t e e e e t e e e e e e e e e e t e te te e e e e e e e t e e e e e e e te e e e e te e e e e e e e e e e e e e rk r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r r se se se s s se se se se se se s s s se e se e s s s e se s e e e s se se s se se se e s s se e e se s se se e e e se e e e e e e e e s e s e e e s e e e s e e e e e e s s s e e s e s s s s s s e k k k k pad yan me inst beb dan ku ku k ku ku ku ku ku k ku ku ku ku ku ku ku ku ku ku ku u ku ku k ku ku ku ku ku ku u ku ku ku ku ku u ku k k ku ku ku u ku ku ku ku ku ku k u ku ku ku k k u k ku ku ku k k k u u u ku ku ku k u u u u k u u u u ku u k ku u u u ku u u k k k k k k ku k u u k u k k k u ku k u u u r r r r r r r r r r r r r r r r

III. BAHAN DAN METODE

3.1 WAKTU DAN TEMPAT

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April sampai dengan Juli 2011, bertempat di Laboratorium Pangan Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional Badan POM RI, Jalan Percetakan Negara No. 23 Jakarta.

3.2 ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat alat KCKT yang terdiri dari pompa Shimadzu, Jepang, detektor ultraviolet Shimadzu, Jepang, detektor fluoresens Shimadzu, Jepang, auto sampler Shimadzu, Jepang, kolom C18 dengan panjang 250 mm, diameter 4,6 mm ukuran partikel 5,0 µm Waters Xbridge, USA dan Shimadzu Shim-pack, Jepang, penyaring 0,2 µm Millipore, penyaring 0,45 µm Millipore, ultrasonik Branson, USA, seperangkat alat spektrofotometer UV-Vis Shimadzu, Jepang, timbangan analitik Precisa, Switzerland dan peralatan gelas. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah pelarut fase gerak berderajat KCKT yaitu metanol Merck, Jerman, asetonitril JT Beaker, USA dan air demineral. Pereaksi dan pelarut organik berkualitas pro analis: butil hidroksi toluena Merck, Jerman, n-pentana Merck, Jerman, 2-propanol Merck, Jerman, tetra-n-butil ammonium hidroksida 0,1 M dalam 2-propanol Merck, Jerman. Bahan baku pembanding yaitu: vitamin A palmitat 1700000 IUg BASF, Jerman, butil hidroksi anisol BPFI, Indonesia, butil hidroksi toluena BPFI, Indonesia, propil galat BPFI, Indonesia, tersier butil hidro kinon BPFI, Indonesia, vitamin D BASF, Jerman, vitamin E BASF, Jerman, beta karoten BASF, Jerman, sampel minyak goreng sawit yang tidak mengandung vitamin A dan beberapa merek minyak goreng sawit yang mengandung vitamin A.

3.1

3. 3. 3. 3.

3 3

3. 3

3. 3.

3. 3

3 3

. 3 3. 3.

3 3

3. 3

3 3

3. 3

3. 3. . .

3 3

. 3

3 3

3 .

. . . .

3 .

2 2

3.3 METODE PENELITIAN

Penelitian ini merupakan percobaan laboratorium yang terdiri dari 3 tiga tahap. Penelitian tahap I merupakan penelitian pemilihan kondisi optimum komposisi fase gerak, laju alir dan detektor yang akan digunakan dalam penetapan kadar vitamin A menggunakan KCKT. Parameter yang dievaluasi meliputi: bentuk kromatogram, waktu retensi Rt, resolusi Rs, jumlah lempeng teoritis N dan tailing faktor Tf. Penelitian tahap II merupakan validasi metode analisis penetapan kadar vitamin A menggunakan KCKT. Parameter validasi yang akan dilakukan adalah: kurva baku dan linieritas, presisi, akurasi, selektivitas, robustness, batas deteksi dan batas kuantisasi metode. Penelitian tahap III merupakan uji coba metode analisis yang telah dikembangkan dan telah divalidasi untuk analisis vitamin A dalam minyak goreng sawit yang beredar di pasaran. Parameter yang diuji adalah penga- matan kromatogram dan penetapan kadar vitamin A.

3.3.1 Penetapan Aktivitas Baku Vitamin A

Aktivitas baku vitamin A ditetapkan sesuai metode Farmakope Inggris 2009, yaitu dengan cara menimbang dengan saksama sejum- lah baku vitamin A palmitat, dilarutkan dengan n-pentana dan diencer- kan dengan 2-propanol hingga konsentrasinya 10 -15 IUmL. Pengu- kuran absorbansi dilakukan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum 326 nm, aktivitas baku vitamin A dalam satuan unit internasional IU per gram dihitung dengan rumus: A26 = absorbansi pada panjang gelombang 326 nm V = total volume pengenceran untuk mendapatkan kadar 10-15 IUmL 1900 = faktor untuk mengkonversi absorbansi spesifik ester retinol menjadi menjadi IU per gram m = bobot substansi yang di uji dalam gram. 3.3 M M ME tiga opt dal die ju ju ju u ju ju ju u ju j j ju ju ju ju ju ju ju ju ju j ju u ju ju ju ju u ju j j u ju ju ju ju ju u ju ju ju j ju ju j ju ju ju ju ju ju j ju ju ju ju j ju u ju u j ju u u u u ju ju u u u u ju ju u u ju j j j ju u u u u u ju u u u ju j j j u j j j j u j ju u u u j u j j m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m ka ka ka ka k ka ka ka ka k k ka ka ka ka ka ka ka k ka ka k k ka ka ka ka ka ka k k k k k k k ka ka k a k k k ka k ka ka k k k ka k k k k ka a ka a k k k ka k k k ka ka ka k ka a a ka a k ka a a a a a a a k ka a a a k ka ka ka a a k ka k a k k k ka ka ka k k k a k a ka a a k a ka k k k k k k k k k k a a a k ka k k k k k k a a a a a a k a k k k k k k k a a a k k a a a d di di di di di di i di di i di di di di di d di d d d di i d d di di di di di di di d d di di di di i i di d d d di di d d d i i i i i d d d d d d d d d i i i i i di i i i i di i i i i i i i d d d d d i i d d i i d i i d d i d d i i d d d d d d d i i d d d d d i i d la l l l l ro ro ro ro ro ro ro ro ro ro ro ro o ro ro ro r ro r ro o o ro o o o o o o o o o ro ro ro ro o o o o o o ro ro o o o o r o o o ro o o ro o o o ro o o o ro r r o o o o o r r r o ro o o r o o o o o o o o r r o o o o o r o o o r r o o o r r r r o o o r r r r o o r r b b b b b b b b di di di i d di di di di d d d d d d d d di d i di di di di i di d d d di d di i di di di di d d di d di i d di i i d i i i di d d d di di i di di di d d d di di di i d di d d d d d di d d d d di di d d d d di di i d d d d di d i i di di d d di d d di i i i d d di d d i i i i di d di di i di d d di d d d di d d di i di di d d i i d di di di d d di i d d d di i i di i d i d d d d d d d d d d d i d i di di d i d d i d d di i i k k k k k go go go go go go go go go go go go go go g g go go go go go g g g go g g o o go go go go go go o o o o o go go o o o go g g g go g go go o o go o g g go g go go o go g g g go o o g g g go o o g g o o go o o o o g g go go g o o o go g g o o g g g o go g o o g g g o o go g r ma ma ma ma ma m ma m ma m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m ma m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m ma m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m m 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3. 3.

3 3

3. 3

3 3

3. 3

3 3. 3 3.

3 3

3. 3

3. 3. 3. 3. 3 3. 3. 3.

3. 3

3 3

3 3. . .

3 .

3 3.

3 3

3. 3

3 3

3 3.

3 3

3 3.

3 3

. 3 3 3.

3 3

. . . 3.

3 3

3 .

3 3

. 3

3 3

. 3

3 .

3 3

3.3.2 Penetapan kondisi optimum KCKT

Larutan baku vitamin A yang akan disuntikkan ke dalam sistem KCKT disiapkan sesuai metode Farmakope Inggris 2009. Metode ini digunakan untuk penetapan kadar vitamin A dalam bentuk baku atau konsentrat vitamin A, sehingga untuk penetapan kadar vitamin A dalam minyak goreng sawit oleh peneliti dilakukan modifi- asi, yaitu penambahan matriks minyak goreng sawit, perubahan konsentrasi baku yang digunakan dan pada proses penyiapan sampel tanpa pemanasan larutan uji. Larutan dianalisis menggunakan KCKT dengan berbagai kondisi percobaan seperti pada Tabel 6 dan analisis untuk setiap kondisi percobaan dilakukan masing-masing dengan 3 kali pengu- angan. Kromatogram yang dihasilkan dievaluasi dengan cara mencatat atau menghitung: waktu retensi Rt, resolusi Rs, jumlah lempeng teoritis N dan faktor ikutan atau tailing faktor Tf untuk masing- masing hasil pada berbagai kondisi percobaan. Kondisi percobaan memenuhi kriteria apabila: waktu retensi Rt 15 menit; resolusi Rs 1,5; jumlah lempeng teoritis N 3000 dan faktor ikutan atau tailing faktor Tf mendekati 1. Untuk mempermudah dalam mengambil keputusan pada pemilihan kondisi optimum, maka setiap parameter kromatogram diberi nilai skor antara 1 - 3. Penentuan nilai skor untuk penilaian kromatogram dapat dilihat pada Tabel 7. Dari hasil tersebut kemudian ditentukan jumlah skor tertinggi yang merupakan kondisi optimum dan selanjutnya digunakan pada penelitian selanjutnya.