Bahan Alat Rancangan Percobaan

35

BAB III BAHAN DAN METODE

3.1 Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini nutrient agar, beef ekstrak, peptone, bacto agar, yeast ekstarak, glukosa, sukrosa, laktosa, ferro sulfat, NaCl, natrium tiosulfat penta hidrat, phenol red, gelatin, magnesium sulfat, asam sitrat, amonium hidrogen posfat , kalium hidrogen posfat, bromotyhymol blue, monokalium posfat, metil red, bromokresol purple, parafin cair, natrium hidrogen posfat, kalium nitrat, asam sulphanic, -naftol, asam asetat, kristal violet, lugol, safranin, hidrogen peroksida, pereaksi kovacks, natrium asetat, toluene, endo agar, kalium sianida, cetrimide agar, aquadest, natrium hidroksida, kalium klorida, asam posfor, chloroform, kalium bikromat, asam sulfat-perak sulfat, ferro sulfat, indikator feroin, sudan black-B. semua berasal dari bahan p.a kecuali methanol dan alkohol teknis.

3.2 Alat

Perlatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas seperti desikator, plat kaca, tabung reaksi, gelas erlenmeyer, gelas beaker, cawan petri, termometer,gelas ukur, buret, instrumen seperti Magnetik stirer, Vortex, Colony Counter, Oven Blower, Autoclave, Inkubator, Rotari Motor, Alat Vakum, Rotari Evaporator, Filter Millipore, Centrifuge, Mikroskop Stereo Unico, Stabinger Viscometer model SVM 3000 Anton Paar, Scanning Electron Microscope JEOL JSM 6360LA, Scanning Calorimeter Mettler Toledo type 821, Fourier Transfer-Infra Universitas Sumatera Utara 36 Red FT-IR Perkin Elmer model 1725X, Spektrofotometer UV-Visible Spektronik 21 D. 3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Penelitian Pendahuluan

3.3.1.1 Pengisolasian Bakteri

Sampel limbah sebagai sumber bakteri yang akan diisolasi berasal dari dua keluaran kolam deoiling dan RANUT, kemudian diencerkan sampai 10 -7 10000000x, ketujuh limbah yang telah diencerkan diambil 1 ml dituangkan kedalamnya media nutrient agar pada cawan petri dan diinkubasi pada suhu 25 o C dalam laminar air flow selama 65 jam. Isolat bakteri yang dianggap potensial diuji dengan cara analisa makroskopis pengamatan visual dari segi bentuk permukaan, pigmen, dan jumlah koloni dengan colony counter dan analisa mikroskopis pengamatan mikroskopis dari segi pewarnaan gram, bentuk sel dan ada tidaknya kapsul pada bakteri tersebut dengan menggunakan mikroskop stereo-unico perbesaran 1250 x. Bakteri yang telah diisolasi, dimurnikan dalam nutrient agar dan dinkubasi dalam inkubator dengan suhu 30 o C. Selanjutnya dilakukan uji biokimia dengan media yang berbeda antara lain: triple medium sugar iron agar TSIA H 2 S dan katalase, sulfite indol motility SIM, simon citrate agar SCA, urease, metil red MR, voges proskauer PV, glukosa, laktosa, sukrosa, D-mannitol, dekarboksilase, oksidasefermentase OF , phenilalanin, reduksi nitrat, oksidase. Universitas Sumatera Utara 37 Dilakukan uji karakteristik kultural antara lain: isolat ditumbuhkan pada media nutrient agar, KCN, toluene 5 dan 10, Endo agar, NaCl 5 dalam nutrient broth dan cetrimide agar berdasarkan American type culture collection catalogue of bacteria and phages Gherna dkk, 1989. Validasi dilakukan perbandingan dengan bakteri strain murni pseudomonas putida dan bacillus megaterium baik secara morfologi makroskopis dan mikroskopis serta uji biokimia, selanjutnya ditentukan berdasarkan Bergey’s manual of determinative bacteriology Holt dkk, 2000.

3.3.1.2 Penyeleksian Bakteri

Kemampuan bakteri dalam mengakumulasikan PHA dapat diketahui dengan dibiakkan dalam media sintetik 1,5 g ekstrak sapi, 2,5 g pepton, 0,5 g yeast ekstrak, dan 1 g glukosa dilarutkan dalam 500 ml aquadest dan disterilisasi pada suhu 121 C. dan dilakukan kontrol dengan Pseudomonas putida. Dengan waktu inkubasi 7 hari, temperatur inkubasi ± 28 C dan pH 7. Optimasi waktu inkubasi 7 hari, temperatur inkubasi 41 C untuk bakteri strain terpilih yang diinokulasikan pada media RANUT tanpa penyaringan dengan nutrisi tambahan 1,5 g ekstrak sapi, 2,5 g pepton, 0,5 g yeast ekstrak, dan 1 g glukosa dan dilakukan kontrol pada penelitian dengan menginokulasikan bakteri tanpa penambahan nutrisi. Universitas Sumatera Utara 38 Optimasi waktu inkubasi 5,6 hari, temperatur inkubasi 37 C untuk bakteri strain terpilih yang diinokulasikan pada media RANUT dengan penyaringan pada kertas saring 48 mm dengan nutrisi tambahan 1,5 g ekstrak sapi, 2,5 g pepton, 0,5 g yeast ekstrak, dan 1 g glukosa. 3.3.2. Penelitian Utama 3.3.2.1 Pengukuran Kurva Pertumbuhan Bakteri 2 liter larutan nutrient broth 6 g ekstrak sapi, 10 g pepton dan 2 liter aquadest yang sudah disterilisasi pada suhu 121 C diinokulasikan kedalamnya bakteri L 1 3 1 kemudian diinkubasikan pada suhu ±30 C dan diaduk dengan menggunakan magnetik bar. Diambil sebanyak 2 ml, dimasukkan ke dalam kuvet untuk diukur absorbansinya pada panjang gelombang 486 nm setiap 12 jam. Dibuat kurva pertumbuhannya. Diukur juga berat sel keringnya dengan mengambil 50 ml dan ditimbang berat sel basah, kemudian dioven pada suhu 105 C, disimpan dalam desikator kemudian ditimbang berat selnya, dihitung berat sel kering dan dibuat kurvanya. Dilakukan hal yang sama untuk limbah RANUT tanpa sterilisasi dan pada panjang gelombang 646 nm. 3.3.2.2 Optimasi Media Biakan dan Kondisi Strain yang terpilih kemudian dibiakkan dengan cara diinokulasikan dalam media LCPKS dari keluaran Ranut dan ditambahkan nutrisi yang sama dengan media Universitas Sumatera Utara 39 sintetik yaitu 3 g ekstrak sapi, 5 g pepton, 1 g yeast ekstrak, dan glukosa yang divariasikan 2, 3, 5, 7,8 g per liter media biakan pengembangan dari metode yang digunakan Das, dkk, 2005, pH diatur tetap 7 dengan penambahan NaOH 0,1N, temperatur inkubasi 25, 27, 30, 33, 35 C , variasi waktu inkubasi 2, 3, 5, 7, 8 hari. Dilakukan analisa berat CDW, PHA, kadar TSS dan kadar COD setelah pemanenan.

3.3.3 Kultivasi Sel Cell Dry Weight CDW

Setelah diinkubasi, sel dipanen dengan cara disentrifugasi pada 9000 rpm selama 12 menit, kemudian dicuci dengan air destilasi steril dan disentrifugasi kembali, lalu sel basah yang diperoleh ditimbang kemudian dikeringkan di atas penangas air selanjutnya disimpan dalam desikator sampai berat konstan untuk kemudian ditimbang Pengembangan metode Clowes dan Hayes, 1968. Berat CDW ditentukan dengan penimbangan, dihitung sebagai berikut: CDW = W 1 = Berat cawan kosong beserta tutup gram W 2 = Berat cawan + sel basah gram W 3 = Berat cawan + sel kering setelah dioven pada suhu 105 o C gram Universitas Sumatera Utara 40

3.3.4 Pengekstraksian dan Purifikasi Polimer PHA

Resuspensi sel yang telah ditimbang dalam 5 ml chloroform:methanol 1:1, dihomogenisasi dengan vortex, ditambahkan volume yang sama untuk 1 M KCl dan 0,2 M asam posfor kemudian dihomogenisasi kembali. Sampel disentrifugasi 10000 rpm selama 2 menit, kemudian diambil fase bawahnya, diuapakan pada suhu ruang. Berdasarkan Protocol Index, 2006 modifikasi Lipid Extraction – Bligh and Dyer, 1959. Berat sel polimer PHA ditimbang dan ditentukan sebagai berikut: PHA = W 1 = Berat cawan + sel PHA gram W 2 = Berat cawan kosong gram

3.3.5 Penentuan Kadar Total Suspended Solid TSS

25 ml larutan biakan disaring dengan filter millipore dan pompa vakum yang sudah ditimbang kertas saring ukuran 47 mm, kertas saring yang digunakan diketahui beratnya A. Kemudian kertas saring yang berisi padatannya dikeringkan dalam oven selama 2 jam pada suhu 105 C, didinginkan selama ±30 menit dalam desikator kemudian ditimbang B dan ditentukan kadarnya sebagai berikut: A = Berat kertas saring g B = Berat kertas saring + contoh kering g Universitas Sumatera Utara 41

3.3.6 Penentuan Kadar Chemical Oxygen Demand COD

1 ml larutan biakan dimasukkan ke dalam tabung destruksi yang telah berisi 2,5 ml larutan K 2 Cr 2 O 7 dan 2,5 ml larutan asam sulfat. Contoh didestruksi selama 2 jam pada suhu 150 C dalam reaktor COD, diangkat dan didinginkan, dilakukan hal yang sama pada blanko yang hanya berisi aquadest. Larutan contoh dan blanko dimasukkan ke dalam erlenmeyer sambil dibilas dengan air destilasi. Kemudian ditambahkan indikator feroin 2 tetes dan dititrasi dengan larutan FeSO 4 sampai larut menjadi cokelat kemerahan. Fp = Faktor pengenceran B = Volume FeSO 4 yang digunakan untuk titrasi blanko ml C = Volume FeSO 4 yang digunakan untuk titrasi contoh ml

3.3.7 Analisa Mikroskopis Granula PHA

Larutan media biakan yang akan dipanen digoreskan dengan loop pada kaca objek, kemudian difiksasikan pada api lampu spritus sampai mengering, setelah itu diteteskan dengan sudan black-B, didiamkan selama 5 menit, dibilas dengan alkohol 70, lalu dicek granulanya dibawah mikroskop stereo-unico dengan perbesaran 1250 x dan difoto dengan kamera digital.

3.3.8 Penentuan Berat Molekul

Berat molekul relatif dari PHA dihitung dengan mengukur viskositas intrinsik [ η] dari 3 ml aliquot 0,1 wtv larutan PHA dalam CHCl 3 menggunakan Stabinger Universitas Sumatera Utara 42 Viscometer model SVM 3000 Anton Paar. Yang kemudian dikonversikan ke persamaan Mark-Houwink Attkins PW, 1990; Sperling, LH, 2006 : [ η] = KM a [ η] = Viskositas intrinsik mPa.s M = Berat molekul gmol K = Konstanta pelarut cm 3 g a = Konstanta pelarut dalam kondisi theta viskositas dinamik pada T C

3.3.9 Analisa FT-IR

Bioplastik PHA digiling dengan menggunakan mortar keramik sampai halus, kemudian ditambahkan pelet KBr dan dicatat spektrum infrared-nya pada range bilangan gelombang 250 sampai 4000 cm -1 dengan menggunakan Perkin Elmer Fourier transform infrared FTIR spectrophotometer model 1725X menggunakan KBr disc.

3.3.10 Analisa Termal Material dengan DSC

Sampel ditimbang 4,5 mg dan dimasukkan dalam cruicible 40 µL. Analisa dilakukan dengan kisaran temperatur -70 sampai 200 o C dengan kecepatan 10 o Cmenit. Digunakan purge gas Nitrogen dengan kecepatan aliran 50mLmin. Alat uji yang digunakan adalah DSC Mettler Toledo type 821. Universitas Sumatera Utara 43

3.3.11 Analisa Scanning Electron Microscope SEM

Bioplastik PHA yang diperoleh ditentukan morfologi permukaan serta penampangnya dengan alat SEM JEOL JSM 6360LA dengan perbesaran 750x dan perbesaran 3000x.

3.4 Rancangan Percobaan

Metode response surface methodology RSM digunakan untuk mendesain percobaan dalam menentukan kondisi optimum proses pengakumulasian PHA dengan menggunakan bakteri dari LCPKS dengan menggunakan tiga faktor sebagai variabel bebas, yaitu: 1. Konsentrasi glukosa gL : 2, 3, 5, 7, 8 2. Temperatur inkubasi C : 25, 27, 30, 33, 35 3. Waktu inkubasi hari : 2, 3, 5, 7, 8 Rancangan percobaan mengikuti bentuk central composite design CCD Montgomery DC, 1991. Titik pusat center point dalam rancangan percobaan CCD merupakan konversi terbaik dari masing-masing variabel yang diperoleh melalui percobaan pendahuluan. Titik pusat tersebut akan disusun sebagai level terkode percobaan yang disajikan pada tabel berikut ini. Universitas Sumatera Utara 44 Tabel 3.1. Perlakuan Terkode untuk pengakumulasian PHA. Perlakuan Terkode Perlakuan -1,682 -1 1 1,682 Konsentrasi glukosa gL 2 3 5 7 8 Temperatur inkubasi C 25 27 30 33 35 Waktu inkubasi hari 2 3 5 7 8 Tabel 3.2. Central Composite Design CCD untuk 3 variabel. Konsentrasi glukosa gL X 1 Temperatur inkubasi C X 2 Waktu inkubasi hari X 3 No. Aktual Kode Aktual Kode Aktual Kode 1 3 -1 27 -1 3 -1 2 7 1 27 -1 3 -1 3 3 -1 33 1 3 -1 4 7 1 33 1 3 -1 5 3 -1 27 -1 7 1 6 7 1 27 -1 7 1 7 3 -1 33 1 7 1 8 7 1 33 1 7 1 9 2 -1,682 30 5 10 8 1,682 30 5 11 5 25 -1,682 5 12 5 35 1,682 5 13 5 30 2 -1,682 14 5 30 8 1,682 15 5 30 5 16 5 30 5 17 5 30 5 18 5 30 5 19 5 30 5 20 5 30 5 Universitas Sumatera Utara 45 3.5 Bagan Penelitian 3.5.1 Pengisolasian Bakteri