Jenis dan Rancangan Penelitian Bahan atau Materi Penelitian Alat atau Instrumen Penelitian Analisis Hasil

32

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk dalam jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak pola satu arah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel penelitian

a. Variabel utama 1 Variabel bebas dalam penelitian ini ialah a Dosis Na 2 CaEDTA 189 mgkg BB tikus. b Dosis ekstrak etanol umbi bawang putih 200 mgkg BB tikus. 2 Variabel tergantung dalam penelitian ini ialah kadar timbal darah tikus yang diukur setelah pemejanan timbal serta pemberian Na 2 CaEDTA dan ekstrak etanol umbi bawang putih. b. Variabel pengacau 1 Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah a Hewan uji yaitu menggunakan tikus putih betina sehat galur Wistar, usia 6 minggu, bobot 100-150 gram. Hewan uji dipilih tikus betina galur Wistar yang sehat supaya kadar timbal yang terabsorpsi benar-benar terkendali dan tidak dipengaruhi kondisi patologis. Hewan uji yang digunakan berusia 6 minggu dengan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI pertimbangan organ-organnya sudah berfungsi sempurna sehingga absorpsi timbal dapat dikendalikan. Kondisi fisiologis hewan uji yaitu bobot 100-150 gram dikendalikan. b Bobot dan jenis pakan yaitu pelet tipe BR2 10 ghariekor supaya kadar timbal yang diabsorpsi hewan uji seragam dan tidak dikacaukan oleh faktor nutrisi. c Air minum yaitu menggunakan aquadest yang diganti baru setiap hari sehingga timbal yang berasal dari air minum dan terabsorpsi hewan uji jumlahnya sama. 2 Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah a Perbedaan fungsi organ tiap hewan uji b Profil farmakokinetika timbal yang berbeda pada hewan uji

2. Definisi operasional

a. Senyawa toksik yang digunakan adalah timbal asetat dosis 0,5 gkg BB yang diberikan selama 30 hari. b. Ekstrak etanol adalah ekstrak etanol umbi bawang putih Allium sativum L. hasil ekstraksi dengan metode maserasi menggunakan etanol 45. c. Uji daya antidot adalah uji potensi penawarracunan menggunakan antiracun Na 2 CaEDTA dosis 189 mgkg BB, setelah 2 jam dilanjutkan dengan ekstrak etanol umbi bawang putih 200 mgkg BB untuk menurunkan kadar timbal darah setelah pemberian timbal asetat selama 30 hari. d. Kadar timbal darah adalah kadar timbal dalam darah tikus, diukur menggunakan metode spektroskopi serapan atom dalam satuan ppm. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

C. Bahan atau Materi Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah serbuk umbi bawang putih Merapi Farma, tikus betina Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Universitas Sanata Dharma, timbal asetat Merck, aquadest, etanol 45 teknis, Na 2 CaEDTA Merck, natrium klorida teknis, asam nitrat 65 pro analisis, Merck, asam perklorat 37 pro analisis, Merck, larutan standar timbal 1000 ppm Merck, kertas alumunium, kertas saring.

D. Alat atau Instrumen Penelitian

Alat yang digunakan adalah spektrometer serapan atom Hitachi Z-8000 Polarized Zeeman, timbangan analitik Mettler Toledo PL303, AB204, GB 3002, heater Barnstead Thermolyne Cimarec ® , hot plate Heidolph MR2002, alat maserasi Innova 2100 Plateform Shaker, oven Memmert, alat-alat gelas Pyrex, pipet mikro 200-1000µl GILSON Z 64581D, yellowtip, pipa kapiler tanpa heparin, eppendorf, spuit injeksi oral dan intramuskular.

E. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi tanaman

Umbi bawang putih Allium sativum L. yang akan digunakan diidentifikasi dan dideterminasi terlebih dahulu oleh determinator di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Umbi bawang putih ini dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku determinasi Anonim, 1995a. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

2. Preparasi bahan

a. Pengumpulan, pengeringan dan penyerbukan umbi bawang putih Pengumpulan, pengeringan dan pembuatan serbuk umbi bawang putih dilakukan oleh petugas di Merapi Farma Kaliurang. Umbi bawang putih berasal dari daerah Brebes, Jawa Tengah yang dipanen pada bulan November 2007 dengan usia panen 6-7 bulan. Serbuk bawang putih disimpan pada suhu kamar 25ºC untuk mencegah tumbuhnya kapang dan jamur, kontaminasi mikroba dan rusaknya za t aktif. Alliiin S-2-propenil- L-sistein sulfoksida akan terurai menghasilkan allicin oleh enzim allinase. Allicin akan mengalami reaksi enzimatis menghasilkan minyak yang mengandung sulfur dialil disulfida dan alil alkohol. NH 2 S COOH O allinase + H 2 O S S O S S 2-Propenyl prope nethiosu lfinate [= Allic in] S-2-Propen yl-L-cystei ne sulfoxide [= Alliin] 2-Propenyl pr ope nethiosu lfinate [= Alli cin] Ga m ba r 1 5 . Rea k si enzim a t is perura ia n a lliin m enj a di a llicin Schm idt ,2 0 0 6 b. Pembuatan ekstrak etanol umbi bawang putih Umbi bawang putih dibuat dalam bentuk sediaan ekstrak dengan metode maserasi. Ekstrak etanol 20 b v dibuat dengan memasukkan 20 gram serbuk umbi bawang putih ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan 75 ml etanol 45, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya, sambil berulang-ulang digojog Anonim, 1986. Selenium yang terikat dalam protein akan terekstraksi lebih banyak karena penggunaan cairan penyari yang sifatnya polar. Penggojogan bertujuan untuk mempermudah proses penyarian zat aktif dari bahan tanaman dan memperbesar kontak serbuk dengan cairan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI penyari sehingga cairan penyari akan membasahi serbuk secara merata. Penggojogan diperlukan untuk meratakan konsentrasi larutan di luar butir serbuk simplisia sehingga derajat perbedaan konsentrasi yang sebesar- besarnya antara larutan di dalam sel dan larutan di luar sel tetap terjaga. Setelah 5 hari, sari diserkai, ampas diperas untuk memisahkan sari dengan ampas dan zat lain yang tidak diinginkan. Ampas ditambah cairan penyari secukupnya, diaduk dan diserkai, sehingga diperoleh seluruh sari sebanyak 100 ml. Bejana ditutup, dibiarkan ditempat sejuk, terlindung dari cahaya, selama 2 hari. Tujuannya untuk mengendapkan zat-zat yang tidak diperlukan tetapi ikut larut dalam cairan penyari. Proses ini dilakukan dalam wadah yang tertutup untuk menghindari tumbuhnya bakteri dan jamur pada ekstrak. Pemekatan dilakukan dengan cara penguapan pada suhu 50°C hingga diperoleh ekstrak kental Anonim, 1986. Tujuan pemekatan ekstrak adalah untuk menghilangkan cairan penyari serta mencegah tumbuhnya kapang, jamur dan bakteri pada ekstrak. c. Pembuatan larutan timbal asetat Serbuk timbal asetat PbCH 3 COO 2 .3H 2 O ditimbang lebih kurang 4,0 gram kemudian ditambah dengan aquadest mendidih 100ºC hingga volumenya 100,0 ml Anonim, 1995b. Larutan yang diperoleh adalah larutan timbal asetat dengan konsentrasi 0,04 mgL. d. Pembuatan larutan natrium kalsiumedetat Na 2 CaEDTA ditimbang lebih kurang 7,56 gram kemudian dilarutkan dengan larutan saline NaCl 0,9 0,1 N Lacy, Amstrong, Goldman, Lance, PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 2003 hingga 500 ml. Larutan yang diperoleh adalah larutan Na 2 CaEDTA dengan konsentrasi 0,01512 mgL. Larutan saline digunakan sebagai pelarut karena sifatnya yang mirip dengan cairan fisiologis tubuh manusia. e. Pembuatan larutan ekstrak etanol umbi bawang putih Ekstrak etanol umbi bawang putih ditimbang lebih kurang 0,8 g kemudian ditambah dengan aquadest hingga volumenya 50 ml. Larutan yang diperoleh adalah larutan ekstrak etanol umbi bawang putih dengan konsentrasi 0,016 mgL.

3. Preparasi dan perlakuan hewan uji

a. Preparasi hewan uji. Hewan uji yang digunakan dibagi menjadi 4 kelompok, masing- masing berjumlah 7 ekor. Sebelum diberi perlakuan, hewan uji diberi larutan timbal asetat 0,5 gkgBB oral selama 30 hari dan disebut kondisi praperlakuan. Kelompok hewan uji dinyatakan sebagai berikut: Kelompok I = kontrol negatif aquadest 0,5 gkgBB. Kelompok II = kontrol posit if timbal 0,5 gkgBB. Kelompok III = kontrol Na 2 CaEDTA 189 mgkgBB selama 10 hari setelah kondisi praperlakuan. Kelompok IV = perlakuan Na 2 CaEDTA 189 mgkgBB, dilanjutkan dengan ekstrak etanol umbi bawang putih 200 mgkgBB selama 10 hari setelah kondisi praperlakuan. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI b. Perlakuan hewan uji. Pada kondisi praperlakuan, larutan timbal asetat 0,5 gkgBB dipejankan secara oral Hariono, 2005 selama 30 hari dengan menganalogikan pejanan timbal yang kronis dan akumulatif pada manusia, sedangkan kontrol negatif diberi aquadest 0,5 gkgBB. Setelah pemejanan timbal asetat selama 30 hari, kadar timbal dalam darah mencapai lebih dari 0,7 ppm Wahyunengsih et al, 2007, Hariono, 2005 dan membutuhkan terapi khelasi Anonim, 2005a. Na 2 CaEDTA 189 mgkgBB diberikan secara intramuskular selama 10 hari setelah kondisi praperlakuan yang merupakan hasil konversi dari dosis manusia 30 mgkg BBhari lampiran 12. Ekstrak etanol umbi bawang putih 200 mgkgBB Senapati, 2001 diberikan 2 jam setelah pemejanan Na 2 CaEDTA secara oral.

4. Preparasi sampel

Darah tikus diambil dari sinus orbitalis mata, ditampung dalam eppendrof. Sampel yang diperoleh ditimbang dan beratnya harus lebih dari 0,5 gram karena kadar timbal dalam darah sangat kecil sehingga diperlukan berat sampel yang cukup banyak untuk dapat terukur. Sampel kemudian didestruksi berdasarkan metode kimia basah wet chemical method dengan menambahkan HNO 3 p sebanyak 10 ml dan HClO 4 0,5 ml. Sampel dipanaskan dengan suhu 200°C hingga jernih, tidak berasap kuning untuk menguapkan pereaksi-pereaksi tersebut, hingga volume yang tersisa 1-2 mL, kemudian didinginkan. Asap kuning adalah gas NO yang dihasilkan dari reaksi tersebut reaksi 12. Sampel hasil destruksi disaring dengan kertas saring. Tujuan filtrasi hasil destruksi untuk PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI menghilangkan endapan yang terbentuk selama proses destruksi terjadi. Selain itu, larutan sampel harus dalam keadaan jernih sebab kejernihan menjadi tanda bahwa seluruh material organik sudah terdestruksi. Filtrat kemudian diencerkan dengan aquadest dan volumenya ditepatkan menjadi 10 ml supaya nilai serapannya dapat terbaca oleh spektrometer serapan atom pada panjang gelombang 283,3 nm dan nilai serapan sampel tersebut berada pada rentang serapan seri larutan baku. Pengukuran dilakukan pada hari ke-0, 15, 30, 35, dan 40 untuk mengetahui profil farmakokinetika timbal dalam darah sebelum dan setelah pemberian Na 2 CaEDTA dan ekstrak etanol umbi bawang putih.

5. Pengaturan spektrometer serapan atom

Spektrometer serapan atom untuk pengukuran kadar timbal diatur sebagai berikut: Sumber cahaya : hollow cathode lamp timbal Arus lampu : 7,5 mA Panjang gelombang : 283,3 nm Oksidan : udara 9,5 litermenit Bahan bakar : asetilena 2,3 litermenit Tinggi tempat serap : 7,5 mm

6. Pembuatan kurva baku

a. Pembuatan larutan baku timbal Larutan standar timbal 1000 ppm diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambah dengan aquadest hingga 10 ml. Larutan yang diperoleh adalah larutan stok timbal dengan konsentrasi 100 ppm. Dari larutan ini, dibuat seri PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI larutan baku dengan konsentrasi 0,5 ppm, 1 ppm, 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, dan 8 ppm. Kurva baku mengandung timbal yang merupakan logam berat dan diukur menggunakan spektrometer serapan atom. b. Pengukuran kurva baku timbal Kurva baku dibuat dengan mengukur nilai serapan seri kadar larutan baku timbal pada panjang gelombang 283,3 nm menggunakan spektrometer serapan atom Subramanian and Meranger, 1981.

7. Penentuan kadar timbal dalam darah sampel

Nilai serapan dan rata-rata konsentrasi yang diperoleh ppm dihitung dengan rumus 13 sehingga diperoleh kadar timbal dalam sampel. gram berat volume blanko ppm - sampel larutan ppm ppm Pb Kadar = 13 Anonim, 1980

F. Analisis Hasil

Data perlakuan yang diperoleh dibandingkan dengan data kontrol. Pada kondisi praperlakuan, kadar timbal dibandingkan dengan kontrol negatif dan positif untuk mengetahui kadar di dalam darah sebelum diberi perlakuan. Setelah diberi perlakuan, kadar timbal darah perlakuan dibandingkan dengan kontrol Na 2 CaEDTA. Untuk kepentingan statistik, maka hipotesis nul H dirumuskan tidak terdapat perbedaan bermakna kadar timbal antara kontrol Na 2 CaEDTA dengan perlakuan ekstrak etanol umbi bawang putih setelah pemberian Na 2 CaEDTA. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Penelitian ini menggunakan taraf kepercayaan 95 karena pengujian dilakukan secara in vivo menggunakan hewan uji dan terdapat pengacau biologis. Langkah awal dilakukan pengujian normalitas data. Jika hasilnya normal maka analisis statistiknya menggunakan ANOVA. Jika menunjukkan hasil yang tidak normal, analisis statistik yang digunakan adalah Kruskal-Wallis dan Friedman. Analisis Kruskal-Wallis digunakan untuk mengetahui perbedaan kadar timbal darah antarkelompok dan dilanjutkan dengan analisis Mann-Whitney. Uji Friedman untuk mengetahui perbedaan kadar timbal darah antarhari pengukuran yang berbeda dalam satu kelompok, kemudian dilanjutkan dengan analisis Wilcoxon. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 42

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan kebenaran tanaman yang digunakan dalam penelitian. Tanaman yang digunakan dalam penelitian ini telah dideterminasi oleh determinator di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dhama, Yogyakarta menggunakan acuan baku Anonim, 1995a lampiran 1.

B. Pengukuran Kadar Timbal Darah

Cara kerja spektrometer serapan atom berdasarkan penguapan larutan sampel dan mengubah logam yang terkandung di dalamnya menjadi atom bebas yang akan menyerap radiasi dari sumber cahaya yang dipancarkan oleh lampu katoda. Spektrometer serapan atom untuk pengukuran kadar timbal menggunakan hollow cathode lamp khusus timbal dengan udara dan asetilen sebagai oksidan dan bahan bakarnya.

1. Kurva baku timbal

Kurva baku dibuat diawali dengan pembuatan seri larutan baku timbal dengan konsentrasi 0,5 ppm, 1 ppm, 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, dan 8 ppm. Serapan seri larutan baku dibaca pada panjang gelombang 283,3 nm dengan spektrometer serapan atom. Panjang gelombang 283,3 nm merupakan panjang gelombang di PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI